Overview
Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia
Electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que separa las moléculas en un campo eléctrico según tamaño y carga. CE se realiza en un tubo pequeño de vidrio llamado un tubo capilar que se llena con una solución electrolítica. Los analitos se separan debido a diferencias en la movilidad electroforética, que varía con la carga, solvente viscosidad y tamaño. Tradicional electroforesis en geles es limitada por la cantidad de voltaje que se puede aplicar porque Julio calefacción efectos arruinará el gel y la separación. Los capilares tienen una relación grande de superficie a volumen superficial y así disiparán mejor el calor. Por lo tanto, los voltajes aplicados para un experimento de la electroforesis capilar son bastante grandes, a menudo 10.000 – 20.000 V.
Electroforesis capilar es útil para separaciones de alto rendimiento. En comparación con cromatografía líquida, separaciones de CE son a menudo más rápida y eficaz. Sin embargo, electroforesis capilar funciona mejor para separar moléculas cargadas, que no es una limitación de la cromatografía líquida. CE tiene una capacidad máxima mayor de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), significando las separaciones son más eficientes y más picos pueden ser detectados. La instrumentación puede ser muy simple. Sin embargo, HPLC es más versátil y muchas fases estacionarias y móvil se han desarrollado para diferentes tipos de moléculas.
Principles
Electroforesis capilar separa moléculas debido a su movilidad electroforética. Movilidad electroforética de una molécula depende de su carga y cuánto es atraído o repelido por el voltaje como la fuerza de arrastre friccional que resiste el movimiento. Fricción es proporcional al radio de la molécula. Así, la movilidad electroforética se basa en tamaño y carga. La velocidad de que una molécula cargada viaja por un tubo capilar es el producto de su movilidad electroforética y el campo eléctrico aplicado. Voltajes más altos, por tanto, conducen a velocidades más rápidas y separaciones más rápidas.
Mayoría de los instrumentos de electroforesis capilar está configurada con tensión negativa en el extremo del detector y el voltaje positivo en la entrada. Esto significa que las moléculas cargadas positivamente migran hacia el cátodo en el final, mientras que moléculas con carga negativa migran al revés. Todas las moléculas se ven en el detector, porque hay un flujo de fluidos a granel llamado flujo electroosmotic. La orden de migración es así moléculas de carga positiva, neutrales y luego-con carga negativa.
Flujo Electroosmotic es causado aplicando un alto voltaje a un pequeño vaso capilar lleno con una solución de sal. Los iones cargados positivamente en la solución de sal forman una doble capa con los grupos silanol cargados negativamente en las paredes del vaso. Cuando un voltaje negativo se aplica al extremo del tubo capilar, tira de los cationes de la capa doble, que también tira la solución alrededor de él debido a las fuerzas de fricción. Este tipo de flujo es en forma de clavija y conduce a menos ampliación de banda que los enchufes de flujo con forma parabólica de HPLC.
Fluyen de las moléculas neutrales de todos en la misma proporción que el flujo electroosmotic. Sin embargo, una fase pseudo-estacionaria puede agregarse al búfer de ejecución a micelas de forma que las moléculas pueden particionar en y fuera de. Una típica fase pseudo estacionaria es dodecylsulfate del sodio. Las micelas son carga negativa en el exterior, por lo que tienen una movilidad electroforética, por lo que el tiempo invertido en la micela determina el tiempo de la migración. Esta forma de la electroforesis capilar se llama cromatografía Electrocinética Micelar (MEKC).
Detección en CE es similar a la de HPLC. UV-Vis es general y no requiere de etiquetado como la molécula tiene un enlace doble. Sin embargo, la absorción depende de la longitud del camino, que es pequeña para un capilar de 50 μm. Una burbuja celda o z aumentará la longitud del camino. Fluorescencia inducida por láser es un método de detección más sensible. Un láser se brilla a través de una ventana en el tubo capilar y la fluorescencia del producto medido. Mientras que la fluorescencia proporciona muy alta sensibilidad, requiere generalmente moléculas al etiquetado porque la mayoría no son fluorescente. Detección electroquímica y detección de espectrometría de masas por electrospray están ganando en popularidad. El problema con cualquiera de estos detectores es que el alto voltaje de la separación debe ser traído a tierra antes de la detección electroquímica y electrospray requieren la aplicación de un voltaje y el voltaje de la CE puede interferir. Nuevos métodos de la tensión de la CE, utilizando electrodos para drenar la corriente o una pequeña grieta en el tubo capilar, la disociación superación estos desafíos.
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Procedure
1. configuración de instrumentación CE
- Encienda el instrumento de la CE y la computadora. Utilizando el software de la computadora, encienda la fuente de luz para el análisis de la UV permitir que se caliente. Algunos programas tienen un indicador cuando la lámpara está lista para usar (icono de la lámpara ilumina en color).
- Hacer un archivo de métodos. Configure los parámetros importantes para el funcionamiento de la CE. En este análisis las temperaturas del almacenaje del cartucho y de la muestra son de 35 ° C. La longitud de onda para la detección de UV es 214 nm.
- Escribir un programa de tiempo. El programa consiste en generalmente pasos de enjuague (para limpiar el capilar antes del análisis), pasos de la inyección y luego un paso de electroforesis. Para el paso de enjuague, realizar 2 enjuagues durante 1 minuto con 20 psi de presión. El primer enjuague es con NaOH, que ayuda a asegurarse de que los grupos silanol de la pared capilar son deprotonated. La segunda aclaración es con tampón de ejecución (aquí para el tampón de borato de 0,025 M) para asegurarse de que el tubo capilar es izquierda equilibrada con el tampón.
- Para la inyección, inyección a presión se utiliza en 0,5 psi para 5 s.
- Para el paso de la electroforesis, las condiciones son separación tensión: 20 kV, tiempo: 5 min, polaridad normal. Para cada paso, también indican que vial es la entrada y que vial es la salida. Guarde el archivo de métodos después de entraron todos los parámetros.
2. preparación de los estándares y las muestras de Soda
- Hacer soluciones madre de 500 ppm de aspartamo, cafeína y ácido benzoico en agua. Tomar 50 mL de cada uno, utilizando un matraz aforado.
- Hacer una solución estándar de aspartamo 150 ppm, 150 ppm cafeína y ácido benzoico de 100 ppm en un matraz aforado de 10 mL.
- Hacer soluciones de cafeína estándar de 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm y 200 ppm en un matraces aforados de 10 mL.
3. ejecutar los ejemplos en la CE
- Coloque los frascos que contienen estándares o muestras de soda en el soporte para el frasco de muestra. Asegúrese de anotar que la muestra está en que ranura. Dos ranuras tienen el borato ejecutar el buffer y la solución de enjuague de NaOH de 0.1 M.
- En el fichero, la entrada ranura que es el primer frasco de la muestra.
- Adquirir una única prueba, asegurándose de que toda la información de datos del programa de entrada las solicitudes.
- Seguir para la adquisición de datos, cambiando el frasco de entrada para cada muestra. Ejecutar la norma de combinación, las 3 concentraciones de cafeína y una Pepsi y diet Pepsi muestra.
- Inserte el blanco en el instrumento y elegir el instrumento adecuado.
- Analizar los datos en el ordenador. Calcular las áreas de pico y superposición de normas y muestras reales para ayudar a identificar picos. Hacer una curva de calibración para los datos de la cafeína.
Electroforesis capilar, o CE, es una técnica utilizada en química analítica para separar las moléculas en un campo eléctrico según tamaño y carga.
Electroforesis capilar se realizan en un tubo de diámetro submilimétrica, llamado un tubo capilar, que contiene una solución electrolítica que fluye. La muestra se inyecta en el tubo capilar, y se aplica un campo eléctrico. Las moléculas entonces se separan en base a la diferencia en la velocidad, que está influenciada por la carga, el tamaño y la viscosidad del disolvente. CE es ideal para la separación de moléculas cargadas y tiene una mayor resolución que la cromatografía líquida de alto rendimiento, lo que es más eficiente y más sensible.
Este video se introducen los fundamentos de la electroforesis capilar y demostrar su uso mediante la determinación de la composición de un refresco.
En la CE, se aplica un campo eléctrico a un capilar llenado con un electrolito. El campo eléctrico induce una carga positiva en la entrada del capilar y una carga negativa a la salida.
Los flujos de electrolitos dentro de los capilares, inducidas por el campo eléctrico. Este flujo, llamada flujo electro-osmótico, es causada por el movimiento de una discreta capa de cargado positivamente iones sal a lo largo de las paredes capilares con carga negativa.
Como el eléctrico actual a través del tubo capilar, las caciones a lo largo de la pared se mueven hacia el extremo negativo. Este flujo de iones tira la solución en el centro a través del tubo.
La muestra entonces se separan moléculas basado en su velocidad dentro del tubo capilar. Esta velocidad, llamada movilidad electroforética, depende de las moléculas carga y tamaño, y cuánto es atraído o repelido por un campo eléctrico.
Las moléculas positivamente cargadas atraviesan más rápido del tubo capilar, ya que son más atraídos por el potencial a la salida. Las moléculas de carga negativa de flujo mucho más lento, ya que son más atraídos por el potencial en la entrada. Moléculas neutras son llevadas junto con el flujo a granel. Así, el orden de las moléculas que salen del tubo capilar es cargado positivamente, neutral y luego de cargado negativamente. Además, el flujo de electrolito tira pequeñas moléculas más rápidamente que moléculas más grandes debido a las fuerzas de fricción.
Las moléculas se registran por un detector, como el UV-Vis, como salir de la columna y se visualizan en una parcela de intensidad de señal de detector frente al tiempo, llamado un electroferograma.
Electropherograms puede producir una variedad de información; tal como muchos compuestos diferentes están presentes en una muestra y la cantidad de cada sustancia.
Ahora que has visto una breve sinopsis de electroforesis capilar, echemos un vistazo a cómo se realiza en el laboratorio.
En primer lugar, encienda la computadora y del instrumento de electroforesis capilar. Luego encienda el detector de UV para permitir que se caliente.
Configure los parámetros para ejecutar el experimento. En primer lugar, ajuste la temperatura para el almacenaje del cartucho y la muestra a 35 ° C y la longitud de onda para la detección de UV a 214 nm.
A continuación, establece los pasos de dos enjuague. El primer enjuague es con hidróxido de sodio para asegurar que los grupos silanol de la pared capilar están protonada. El segundo enjuague utiliza el buffer corriente se equilibren el capilar. A continuación, establezca la muestra a inyectar a 0,5 psi 5 s.
Ajustar el paso de la electroforesis, mediante la selección de la tensión de separación. En este caso, utilice 20 kV durante 5 minutos con polaridad normal, lo que significa que el campo eléctrico es positivo en la entrada y negativo en la salida.
En primer lugar, preparar 50 mL soluciones del aspartame de la soda componentes, cafeína y ácido benzoico en 500 partes por millón en agua.
De las soluciones madre, hacer una solución estándar de aspartamo 150 ppm, 150 ppm cafeína y ácido benzoico de 100 ppm.
Luego, realizar 4 soluciones de cafeína en 50, 100, 150 y 200 ppm. Estas muestras se utilizarán para hacer una curva de calibración. Para obtener más información, consulte esta colección de video en las curvas de calibración.
Finalmente, para preparar las muestras de soda desgasificando con nitrógeno. Se analizarán las muestras de soda con ninguna dilución.
Colocar los frascos con las muestras estándar o soda en el soporte para el frasco. Coloque los frascos que contienen el búfer de ejecución y la solución de lavado de hidróxido de sodio en el portamuestras. Asegúrese de registrar la ubicación de cada uno.
En el software del instrumento CE, indican que las ranuras contienen las soluciones de dos enjuague y el primer frasco de la muestra. Ahora, ejecuta la primera muestra.
Luego, ejecute la norma de combinación, 4 concentraciones de cafeína y un regular y muestra de soda de la dieta cambiando el vial de entrada.
Cuando todas las soluciones se han separado, analizar los datos.
En primer lugar, utilizar las normas para identificar los picos de las muestras de soda. Una comparación de los tres picos observados en la muestra de soda de dieta a los estándares muestra que cafeína, aspartamo y ácido benzoico presentes en la soda de dieta. En la muestra de soda regular, sólo el pico de cafeína es picos de actualidad, pero no el aspartamo y ácido benzoico.
Luego, calcular el área de pico para cada solución patrón de cafeína y hacer una curva de calibración. La curva de calibración para la cafeína puede utilizarse para calcular la concentración de cafeína en cada muestra.
Electroforesis capilar se utilizan para muchas separaciones de especialidad en entornos académicos e industriales.
CE a menudo se utiliza como un componente de la prueba de control de calidad de industria farmacéutica. Drogas, ya sea como pequeñas moléculas o productos biológicos, se pueden ejecutar mediante electroforesis capilar para ver si los productos secundarios están presentes. También puede ser utilizado para determinar si las proteínas se pliegan correctamente, como plegable puede afectar la carga de la proteína.
CE puede utilizarse también para separar el ADN. Usando una placa de micropocillos y múltiples arreglos de discos de los capilares, los investigadores pueden aumentar el rendimiento de un experimento único, como se muestra aquí. Fragmentos de ADN se separaron en base a tamaño, con una resolución de 1 par de base. Esto hace posible, junto con la determinación de otros parámetros como variantes de número de copia, que se utiliza para diagnosticar enfermedades genéticas posibles fragmentos de la secuencia de ADN.
Una proteína puede modificarse por varios grupos funcionales que se unen químicamente a diferentes lugares. Diversas copias de la misma proteína pueden variar con diferentes modificaciones, que cambiarán la carga y el tamaño de cada proteína. Atraviesa las proteínas purificadas de una CE que esté acoplado a un espectrómetro de masas puede separar proteínas basadas en que modificaciones están presentes y también identifican el tipo y la ubicación de la modificación.
Sólo ha visto la introducción de Zeus para electroforesis capilar. Ahora debería entender cómo CE separa moléculas basadas en carga y masa y cómo ejecutar una muestra sobre el CE en el laboratorio.
¡Gracias por ver!
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Results
Electropherograms recogidas para dieta Pepsi y Pepsi muestras se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente. Los tres picos de la cafeína, el aspartamo y el ácido benzoico se observan en la dieta Pepsi y tienen tiempos similares de migración como los estándares. Para Pepsi regular, el pico de cafeína está presente pero no los picos del aspartamo y ácido benzoico. El análisis de la CE es rápido como los tiempos de migración son sólo 3-4 minutos.
La curva de calibración para cafeína se muestra en la figura 3. Esta curva puede usarse para calcular la concentración de cafeína en cada muestra.
Figura 1. Análisis de la CE de Pepsi de dieta. Los rojos son estándares de cafeína, aspartamo y ácido benzoico. El negro es una dieta Pepsi muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Análisis de la CE de Pepsi. El negro es una muestra de Pepsi mientras que el rojo es una muestra de las normas de la cafeína, aspartamo y ácido benzoico. No hay aspartame o ácido benzoico, indicando que la sosa no es dieta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Parcela de calibración de cafeína con el CE. Una parcela del pico zona vs concentración de cafeína estándares medidos con CE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Applications and Summary
Electroforesis capilar se utilizan para muchas separaciones de especialidad. Por ejemplo, se utiliza en la industria farmacéutica para la prueba, para asegurarse de que no hay productos secundarios ni interferentes de la calidad. CE es particularmente útil para la separación de drogas con un grupo amino básico, como las paredes del tubo capilar pueden hacerse neutras con un pH ácido y así la droga no se pegue en el capilar.
Un modo de CE también se utilizó para secuenciar el genoma humano y separar el ADN. Este modo de CE es la electroforesis capilar y para estas separaciones, un polímero se inyecta en el tubo capilar de la CE. El polímero da un modo adicional de separación, basado en el tamaño, como los fragmentos más pequeños pueden viajar más rápido a través del gel. Esto se llama tamizado, y junto con la separación electroforética, tiene 1 resolución de pares para el análisis de ADN.
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