Overview
Fuente: Laboratorio del Dr. B. Jill Venton - Universidad de Virginia
Cromatografía de intercambio iónico es un tipo de cromatografía que separa analitos en carga base. Una columna de relleno con una fase estacionaria cargada sobre un soporte sólido, llamado una resina de intercambio iónico se utiliza. Cromatografía de intercambio catiónico fuerte preferentemente separa a cationes mediante el uso de una resina con carga negativa mientras que la cromatografía de intercambio aniónico fuerte preferentemente selecciona a aniones usando una resina cargada positivamente. Este tipo de cromatografía es popular para la preparación de la muestra, por ejemplo en la limpieza de las proteínas o ácidos nucleicos de muestras.
Cromatografía de intercambio iónico es un proceso de dos pasos. El primer paso, la muestra se carga sobre la columna en un tampón de carga. La fijación de la muestra cargada con la resina de la columna se basa en interacciones iónicas de la resina para atraer a la muestra de la carga opuesta. Así, las muestras cargadas de polaridad opuesta a la resina están limitadas fuertemente. Otras moléculas que no están cargadas o de la carga opuesta no están limitados y se lavan a través de la columna. El segundo paso es a fin de eluir el analito que se enlaza a la resina. Esto se logra con un gradiente de sal, donde poco a poco se aumenta la cantidad de sal en el búfer. Fracciones se recogen al final de la columna como se produce la elución y la muestra purificada de interés puede ser recuperada en una de estas fracciones. Otra técnica, como la espectroscopia, puede ser necesaria para identificar la fracción que contiene la muestra. Cromatografía de intercambio iónico es especialmente útil en estudios de la proteína, para aislar las proteínas de interés que tienen una carga específica o el tamaño, tamaño puede determinar el número de interacciones con la resina.
Cromatografía de intercambio iónico es una técnica de separación más general que la cromatografía de afinidad, que es también de uso frecuente en la preparación de las muestras de proteína, donde un anticuerpo está enlazado a una columna para enlazar un analito. Debe adquirirse una nueva columna de afinidad para cada analito, mientras que el mismo tipo de columna de intercambio iónico, a menudo con diferentes condiciones de elución, se puede utilizar para limpiar muchas proteínas de la misma carga. Cromatografía de intercambio iónico puede utilizarse también en combinación con otros tipos de cromatografía que separan en base a otras propiedades. Por ejemplo, se separa de la cromatografía por exclusión de tamaño según el tamaño y podría ser utilizado antes de la cromatografía de intercambio iónico para elegir compuestos de solamente un tamaño determinado.
Principles
Cromatografía de intercambio iónico se rige por los principios de las interacciones químicas iónicas que conducen a la adsorción reversible de analito en la fase estacionaria. La fuerza de la vinculación entre la muestra y el soporte sólido se rige por el número y tipos de grupos funcionales en la muestra y la resina. El tampón de carga generalmente tiene baja conductividad para promover las interacciones entre la muestra y la resina. Resinas de intercambio catiónico fuerte típicamente cuentan con grupos de ácido sulfónico funcionales mientras que las resinas de intercambio catiónico débil tienen ácidos carboxílicos. Resinas de intercambio aniónico fuertes contienen aminas cuaternarias y resinas de intercambio aniónico débil aminas secundarias o terciarias característica. Los términos fuertes y débiles se refieren a las propiedades ácido/base del material de columna y no lo bien une un analito. Resinas débiles se cargan en un rango de pH más pequeño que las resinas fuertes, pero todavía enlazar los analitos muy con eficacia y podrían ser una buena opción si se cobran en el rango de pH necesitado. Antes de usar, columnas de intercambio iónico están equilibrados en un pH mediante un tampón de equilibrado.
Para eluir la muestra de interés, se utiliza un gradiente de sal. Las muestras menos firmemente enlazados a la resina se procederá a la elución en primer lugar, como la sal le molestará más fácilmente su vinculación iónica a la columna. Las muestras que son más bien encuadernado elución después, cuando se utilizan altas cantidades de sal. Normalmente, se utiliza un degradado lineal de sal, donde la concentración de sal aumenta con el tiempo de forma lineal. Sin embargo, los gradientes de paso pueden usarse donde la concentración de sal es intensificada con el tiempo.
Una consideración importante para los experimentos de intercambio iónico es el pH de los buffers. El pH debe ser mantenido para que el analito de interés se cobra y se unirá a la resina. Para las proteínas, la carga se basa en el punto isoeléctrico de la proteína, donde la proteína es neutral cargada y medido como pI. El pH en comparación con el pI de la proteína da información sobre la carga de la proteína esperada. En cromatografía de intercambio catiónico, elevando el pH hará que el analito que menos positivamente cargada y menos propensas a interactuar con la carga negativa resina. Del mismo modo, en cromatografía de intercambio aniónico, bajando el pH hará que el analito que carga menos negativa y menos propensos a interactuar con la resina cargada positivamente. Así también pueden utilizarse ajustes de pH para selectivamente eluir los analitos de la columna. El uso de ajustes de pH en lugar de sales podría ser ventajoso para separar dos tipos de proteínas diferentes con valores de pI diferente.
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Procedure
1. preparación de la muestra y la columna
- En esta demostración, una mezcla de 2 proteínas se separan en una columna de intercambio catiónico: la hemoglobina y el citocromo C. agregar 0,2 mL de tampón de equilibrado (pH 8.1) a la muestra de proteína y vortex para mezclar bien. Centrifugar durante 2 min eliminar cualquier espuma.
- Colocar la columna de intercambio catiónico en un tubo de ensayo durante 5 minutos permitir que la resina resolver. Abrazadera para el tubo de ensayo con la columna en un soporte de anillo para asegurarse de que esté en posición vertical.
- Abra la tapa superior de la columna y luego la tapa inferior. Permitir que el tampón en la columna gotee hacia fuera bajo gravedad en el tubo de ensayo.
- Lavar la columna dos veces con un columna de volumen (en este caso el volumen de la columna es de 0,3 mL) de tampón de equilibrado. Que el primer volumen de columna (0,3 mL) de goteo de tampón de equilibrado hacia fuera en el frasco de residuos antes de agregar el segundo volumen de la columna. Este paso permite la columna de equilibrar con el tampón de equilibrado. Añadir el tampón de equilibrado lentamente en este paso para no perturbar la resina.
2. ejecución de una muestra de proteína a través de una columna de intercambio catiónico
- Poner la columna en un tubo de centrífuga de 2 mL con la etiqueta "Sin consolidar 1". Cuidadosamente coloque 0.1 mL de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.
- Una vez que la muestra ha sido cargada en la parte superior de la columna, lavar con 0,3 mL de tampón de equilibrado por agregar el buffer en la parte superior de la columna y dejándola gotear a través de todo el camino. Repita este paso x 4 (para un total de 5 lavados) y recoger cada lavado en un tubo de centrífuga separado, 2 mL. Etiquetar los tubos como "Desatados 1-5".
- Para los últimos 2 lavados, centrifugue durante 10 s a 1.000 x g para asegurarse de que todas las especies salen de la columna. Cualquier muestra que se une a la columna no debe ser en estos lavados, pero muestra que no se lave bien. Centrifugación proporciona más fuerza para lavar materiales no consolidados de la columna.
- Poner la columna en un tubo nuevo de colección 2 mL centrífuga con la etiqueta "destino 1". Poner 0,3 mL de tampón de elución (alta sal, pH 5.5) en la parte superior de la columna. Centrifugue el eluyente resultante de 10 s a 1.000 x g.
- Repita el paso de elución 2 veces más, colocando la columna en un nuevo tubo de centrífuga, agregar 0.3 mL, y centrifugar por 10 etiqueta s. estos "Bound 2 y 3".
- Registrar cualquier cambio de color u observaciones sobre las fracciones. La hemoglobina es una proteína de color que se ve rojizo mientras que el citocromo C es de color rojizo.
3. resultados: Intercambio catiónico de la hemoglobina y el citocromo C
- Citocromo C tiene un pI de 10.5 y un pI de 6,8 de la hemoglobina. Así, cuando se utiliza un tampón de equilibrado pH 8.1, la hemoglobina no se une a la columna porque está cargado negativamente. Citocromo C se carga positivamente a este pH y se unen a la columna porque el pH < pI.
- Hemoglobina se observa en la fracción no unida porque no está enlazado a la columna.
- Citocromo C se observa en fracciones consolidados, ya que fue enlazado a la columna de intercambio catiónico.
Figura 1. Foto de la fracción no unida (hemoglobina) y fracción unida (citocromo C).
Cromatografía de intercambio iónico se utiliza ampliamente en la separación y aislamiento de compuestos cargados, particularmente grandes biomoléculas.
Este tipo de cromatografía líquida utiliza una columna de llenos granos de fase estacionaria, llamado resina. La técnica separa analitos basados en su afinidad con la resina cargada.
Hay dos tipos principales de esta técnica. En cromatografía de intercambio catiónico, resina con carga negativa se utiliza para enlazar analitos cargados positivamente. Del mismo modo, en intercambio, analitos cargados negativamente se unen a resina cargado positivamente. Los compuestos son lavados a través de la columna, y el analito entonces puede ser colectado en un recipiente separado.
Este video se introducen los fundamentos de la cromatografía de intercambio iónico y demostrar la técnica de separación de una mezcla de proteína en el laboratorio.
La fase estacionaria es un componente clave para una exitosa separación. Resinas de intercambio catiónico fuerte normalmente cuentan con fuertes grupos funcionales ácidos, como ácido sulfónico. Resinas de intercambio catiónico débil disponen de grupos débiles, tales como ácidos carboxílicos.
Del mismo modo, resinas de intercambio aniónico fuerte utilizan bases fuertes, como las aminas cuaternarias, mientras que las resinas de intercambio aniónico débil utilizan aminas secundarias o terciarias. La selección de la resina dependerá de las propiedades de la mezcla de muestra y el analito de interés.
Los buffers usados, colectivamente llamados la fase móvil, también son importantes a la separación, particularmente en términos de pH. Para las proteínas, pH se selecciona de acuerdo con su punto isoeléctrico o pI. En un pH igual al pI de la proteína, la proteína es neutral. Sobre pI, tendrá una carga negativa neta, mientras que por debajo de la pI, tendrá una carga positiva neta. El pH del buffer debe seleccionarse para que la proteína está correctamente cargada y capaces de enlazar con la fase estacionaria.
Cromatografía de intercambio iónico es generalmente un proceso de cuatro pasos. En primer lugar, una columna empaquetada con cualquier resina de intercambio aniónico o catiónico es equilibrada mediante buffer. Para columnas de intercambio, esto implica protonating la resina, asegurando que se carga positivamente.
A continuación, la muestra se carga sobre la columna. El buffer debe tener baja conductividad, como especie cargada puede competir con la muestra para las interacciones con la resina. Compuestos de carga opuesta se unen a la resina. Moléculas que no están cargadas, o llevan la misma carga, siguen sin estar consolidadas.
En el tercer paso, la columna se lava con buffer adicional para eliminar los componentes no enlazados de la columna, dejando el límite.
Finalmente, el cuarto paso es la elución del analito límite. Esto se logra utilizando un gradiente de sal, donde se aumenta gradualmente la concentración de sal, o utilizando un tampón de elución sal alta.
Las moléculas débilmente enlazados se eluyó en primer lugar, como la sal baja más fácilmente alterará su vinculación iónica a la resina. Compuestos que más fuertemente se procederá a la elución con altas concentraciones de sal.
Ahora que los fundamentos de la cromatografía de intercambio iónico han sido descritos, permite echar un vistazo a su uso en la separación de dos proteínas.
En primer lugar, para preparar la mezcla de proteína de separación, agregar 0,2 mL de tampón de Unión y de vortex para mezclar bien. Luego, centrifugar la mezcla para eliminar cualquier espuma. Para preparar la columna de intercambio catiónico, sujete verticalmente en un soporte de anillo y deje que la resina resolver.
Abra la tapa superior de la columna y luego la parte inferior. Permitir que el tampón de escurra bajo gravedad en un tubo de abajo.
Para preparar la columna, equilibrar por la carga de un columna-volumen de buffer, en este caso 0,3 mL. Deje que el búfer de gotear de la columna en un frasco de residuos. Después de que ha salido de un columna-volumen de tampón, repita el paso equilibrado.
Para ejecutar el experimento, colocar un tubo de centrífuga de 2 mL con la etiqueta "Sin consolidar 1" debajo de la columna. Cuidadosamente coloque 0.1 mL de la muestra de proteína en la parte superior de la columna.
Una vez que se ha cargado la muestra, lavar con un volumen de columna de búfer y permitir que fluya a través de todo el camino. Repita para un total de 5 lavados. Recoger cada colada en su propio tubo, con la etiqueta "Sin consolidar 1" a "5". Para los últimos 2 lavados, centrifugar la columna de 10 s para asegurarse de que todas las especies salen de la columna. Poner la columna en un tubo de colección de nuevo 2 mL centrífuga y una etiqueta "Bound 1". Carga de columna 1-volumen de tampón de elución en la cima de la columna. Centrifugar durante 10 s a 1.000 x g.
Repita el paso de elución 2 veces más para la colección del analito límite. Etiquetar los tubos "Límite 2" y "3". Registrar cualquier cambio de color u observaciones sobre las fracciones.
En este ejemplo, la hemoglobina y el citocromo C se separaron. Hemoglobina tiene un pI de 6,8, mientras que el citocromo C tiene un pI de 10.5. En el buffer de pH 8.1, la hemoglobina se carga negativamente y no se une a la columna. Por el contrario, el citocromo C está cargado positivamente a pH 8.1 y se une a la columna.
Hemoglobina, una proteína de color pardusca, se encontró en las fracciones no Unidas, mientras que el citocromo C, una proteína de color rojizo, fue observado en la fracción unida.
Hay muchas formas de cromatografía de líquidos, cada uno con diferentes habilidades para separar componentes de una mezcla.
En este ejemplo, cromatografía en columna se utiliza para separar una mezcla de simple y doble trenzado DNA. Hidroxiapatita, o HA, es una forma cristalina de fosfato de calcio se utiliza comúnmente como una fase estacionaria debido a sus iones de calcio cargados positivamente. En este caso, la columna HA era ideal para la separación de ADN como puede enlazar a espina dorsal el ADN cargado negativamente.
Otra forma de cromatografía en columna utilizada con frecuencia para separar las proteínas es la cromatografía de afinidad metálica inmovilizados, o IMAC. En IMAC, la fase estacionaria posee un ligando con un ion de metal, que se une a una etiqueta de histidina en la proteína de interés.
Todos los demás componentes de la mezcla de salida de la columna. La proteína entonces es eluted con una solución de imidazol, que tiene una estructura similar a la histidina y se une más fuertemente con los iones metálicos.
Una aplicación común de cromatografía en columna es cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC. HPLC es ampliamente utilizado en química analítica para la identificación y separación de compuestos biológicos y no biológicos en una mezcla.
HPLC es similar a la cromatografía de columna demostrada en este video, salvo que es automatizado y operado a presiones muy altas. Esto permite el uso de pequeños granos de fase estacionaria, con un mayor área superficial al cociente del volumen. Así, mejora las interacciones entre la fase estacionaria y los componentes en la fase móvil son posibles.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a la cromatografía de intercambio iónico. Ahora debe entender los conceptos detrás de él, los 4 pasos y algunas técnicas relacionadas.
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Applications and Summary
Cromatografía de intercambio iónico es ampliamente utilizada en bioquímica para aislar y purificar las muestras de proteína. Las proteínas tienen muchos aminoácidos con grupos funcionales que se cargan. Las proteínas se separan en base a la carga neta, que es dependiente del pH. Algunas proteínas son cargadas más positivamente mientras que otros están cargados más negativamente. Además, péptido pueden ser genéticamente agregan etiquetas a una proteína para darle un punto isoeléctrico que es no en la gama de proteínas normales, lo que es posible separar completamente. Cromatografía de intercambio iónico es útil para la separación de complejos de la proteína multimérica, como diversas configuraciones diferentes cantidades y diferentes interacciones.
Otra importante aplicación de cromatografía de intercambio iónico es el análisis de agua. Cromatografía de intercambio aniónico se puede utilizar para medir la concentración de aniones, como sulfatos, nitratos, nitritos, flúor y cloruro. Cromatografía de intercambio catiónico se utiliza para medir la concentración de cationes como sodio, potasio, calcio y magnesio. Un tipo de cromatografía de intercambio iónico también se utiliza en la purificación de agua, filtro suavizadores de agua como la mayoría de los iones magnesio y calcio en agua dura por atar a una resina, la cual libera sodio dependiente. Metales pesados, como cobre o plomo, también puede extraerse agua mediante cromatografía de intercambio iónico.
Cromatografía de intercambio iónico también es útil en la purificación del metal. Puede utilizarse para purificar el actanides, como el plutonio y quitar de barras de combustible de reactor nuclear gastado. También puede utilizarse para buscar uranio y eliminar del agua u otras muestras ambientales.
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