6: Imágenes de fluorescencia infrarroja de aneurismas aórticos abdominales

El siguiente procedimiento proporciona los pasos detallados necesarios para recopilar imágenes in vivo y ex vivo DE NIRF de animales pequeños:

1. Configuración experimental

1. Conecte una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia mediante una guía de luz de fibra óptica.
2. Seleccione el filtro de excitación adecuado para el experimento. El filtro de excitación determina la longitud de onda de la luz que se entregará a la muestra y debe elegirse para que coincida con el espectro de excitación del fluoróforo introducido en la muestra.
3. Seleccione el filtro de emisión adecuado. El filtro de emisión bloquea los componentes espectrales no deseados, que pueden atribuirse a la autofluorescencia, y deben elegirse para que coincidan con el espectro de emisión del fluoróforo.

2. Preparación de muestras

1. In Vivo
   1. Anestetizar al animal en una cámara de inducción utilizando isoflurano a una concentración de 3-4% en la esfera del caudalímetro.
   2. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes y mantenga el isoflurano en una concentración de 1-2%. Una fuente de calor no es necesaria porque los animales normalmente sólo se imaginan durante un corto período de tiempo (> 5 min), y su temperatura corporal no disminuye sustancialmente.
   3. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Retire el vello de la región de interés aplicando una crema depilatoria.
   4. Aplicar crema depilatoria en la zona más pequeña necesaria. Después de 30 s, límpielo con una gasa. Limpie la zona por segunda vez con una gasa humedecida con alcohol etílico para eliminar por completo la crema depilatoria.
   5. Aplique pomada oftálmica en los ojos para evitar el secado de las córneas.
   6. Inyecte la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para esta aplicación específica, las sondas activables MMP2 se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola. En este punto, se puede crear una imagen del ratón. Proceda a la "Adquisición de imagen" de este protocolo para continuar. Supervise al animal para la respiración regular durante todo el breve procedimiento.
2. Ex Vivo
   1. Después de la inyección de la sonda fluorescente, eutanasia al animal de una manera humana de acuerdo con las Directrices AVMA 2013 para la eutanasia de los animales. La sobredosis de dióxido de carbono (CO₂₎es una práctica estándar para la eutanasia de animales pequeños.
   2. Extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés y retire cuidadosamente el exceso de tejido adiposo con fórceps.
   3. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual y colocar la muestra directamente en la etapa de toma de imágenes.

3. Adquisición de imágenes

1. Abra el software de imágenes moleculares y encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.
2. Abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen: Exposición estándar para capturar una sola imagen, Exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y Exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.
3. Seleccione UV-Transillumination como fuente de iluminación.
4. Utilizando la imagen previsualizada como referencia, ajuste el enfoque de la lente, el campo de visión y la f-stop/aperture en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra.
5. Cierre la ventana de vista previa y asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro.
6. Haga clic en 'Exponer' para adquirir y guardar la imagen.
7. El software de imágenes moleculares estándar normalmente proporciona una variedad de herramientas analíticas, de medición y de corrección de imágenes para cuantificar las señales de fluorescencia para el análisis de imágenes.
8. Al final de la sesión de imágenes, retire la muestra/animal, apague el sistema y limpie la etapa de diagnóstico para minimizar los daños en el sistema.

Las imágenes de fluorescencia en el infrarrojo cercano son una técnica óptica que utiliza sondas fluorescentes para visualizar ensamblajes biomoleculares complejos en tejidos. Esta técnica de imagen no invasiva, que también se conoce como NIRF, es rápida y no requiere radiación ionizante.

En NIRF, las sondas fluorescentes se pueden conjugar con moléculas pequeñas para una mayor especificidad para estudiar la progresión del cáncer y las enfermedades cardiovasculares. Son excitados por la luz infrarroja cercana que penetra profundamente en el tejido y se pueden utilizar para delinear el tejido sano del tejido enfermo que altera la concentración de estas moléculas objetivo.

Este video ilustrará los principios detrás de las imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano, así como la forma de realizar experimentos in vivo y ex vivo en animales pequeños para estudiar una variedad de enfermedades.

Como su nombre indica, las imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano utilizan la luz dentro de la primera ventana del infrarrojo cercano, que oscila entre los 650 nanómetros y los 900 nanómetros, para introducir fotones en el tejido. Las moléculas fluorescentes específicas de un objetivo, llamadas fluoróforos, generalmente se introducen en un animal a través de ingeniería genética o inyección antes de la obtención de imágenes.

Estos fluoróforos absorben la energía de los fotones, lo que eleva la energía de las moléculas desde el estado fundamental S0 hasta el estado excitado inestable S1 prime. Debido a que este estado es inestable, las moléculas se relajarán al nivel de energía vibratoria más bajo dentro del estado excitado, liberando su energía en forma de calor. Los fluoróforos, ahora en el estado excitado relajado S1, luego regresan al estado fundamental, emitiendo luz de una longitud de onda específica.

Esta luz tiene una longitud de onda más larga que la luz introducida originalmente en el fluoróforo debido a la energía que se disipa en forma de calor a medida que la molécula se relaja al nivel de energía vibratoria más bajo. A continuación, la luz emitida se captura y registra mediante un sistema de imágenes de fluorescencia.

Un gráfico de los espectros de absorción y emisión del fluoróforo muestra la gama de longitudes de onda que el fluoróforo puede absorber y emitir, respectivamente. Este cambio fundamental, que es la diferencia en nanómetros entre las longitudes de onda de absorción máxima y de emisión máxima, se denomina desplazamiento de Stokes. Cada fluoróforo tiene un desplazamiento de Stokes distinto que permite distinguir la luz de emisión de la luz excitante y hace posible técnicas de imagen como NIRF.

Después de haber revisado los principios fundamentales de las imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano, veamos ahora el procedimiento paso a paso para preparar y obtener imágenes de un animal.

Primero, use una guía de luz de fibra óptica para conectar una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia. Seleccione el filtro de excitación que coincida con el espectro de excitación de la fluorescencia que se introducirá en la muestra para garantizar que se entregue la longitud de onda correcta de la luz.

A continuación, seleccione el filtro de emisión adecuado para que coincida con el espectro de emisión del fluoróforo, lo que bloqueará los componentes espectrales no deseados que puedan atribuirse a la autofluorescencia.

Para comenzar a prepararse para la obtención de imágenes in vivo, use isoflurano para anestesiar al animal en una cámara de desmontaje. Transfiera al animal a un cono de nariz que se fija en la platina de imagen. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Aplica una crema depilatoria para eliminar el vello de la zona de interés. Luego, aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar que las córneas se sequen.

Después de esto, inyecte la sonda molecular fluorescente activable en el animal. Para comenzar la adquisición de imágenes, abra el software de imágenes moleculares. Encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.

A continuación, abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuada para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen la exposición estándar para capturar una sola imagen, la exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y la exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.

A continuación, seleccione Transiluminación UV como fuente de iluminación. Utilizando la imagen de vista previa como referencia, ajuste el enfoque, el campo de visión y el número F en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de la imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra según sea necesario. Después de esto, cierre la ventana de vista previa. Asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro. Haga clic en "Exponer" para adquirir y guardar la imagen.

Para prepararse para la obtención de imágenes ex vivo, se debe sacrificar al animal de manera humanitaria después de la inyección de la sonda fluorescente. Con unas pinzas, retire con cuidado el exceso de grasa periaórtica. A continuación, extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés. Enjuague el tejido con solución salina tamponada con fosfato para eliminar la sangre residual. A continuación, coloque la muestra directamente sobre la platina de obtención de imágenes.

Obtener imágenes del tejido ex vivo siguiendo el mismo protocolo descrito para la obtención de imágenes in vivo. Cuando haya terminado, retire la muestra de la etapa. Apague el sistema y limpie la platina de imagen.

Ahora que hemos completado el protocolo para obtener imágenes de campo infrarrojo cercano, revisemos los resultados de esas exploraciones.

En estas imágenes representativas, se inyecta sistémicamente una sonda fluorescente activable a través de la vena de cola para visualizar la metaloproteinasa de matriz o MMP2. Aquí vemos una imagen NIRF in vivo de un ratón con deficiencia de apolipoproteína-E que desarrolló un aneurisma de aorta abdominal después de la infusión de angiotensina II. Si bien la mayoría de los pequeños puntos de alta señal se deben a la autofluorescencia de la piel, la vasculatura se presenta visualmente como estructuras tubulares con altas señales fluorescentes.

La segunda imagen representativa compara imágenes NIRF de aneurismas de aorta abdominal de dos modelos animales diferentes. Uno, un aneurisma suprarrenal de aorta abdominal en un ratón con deficiencia de apolipoproteína-E con infusión de angiotensina II. Y dos, un aneurisma de aorta abdominal infrarrenal en una rata infundido con elastasa pancreática porcina.

En cada uno de ellos, observamos un aumento de la actividad de MMP2 en la región aneurismática de la aorta abdominal. El exceso de sondas fluorescentes se filtra y se acumula en los riñones, lo que explica las señales fluorescentes brillantes que se observan allí.

Veamos ahora algunas otras aplicaciones de las imágenes de campo infrarrojo cercano. En primer lugar, las imágenes NIRF se pueden utilizar para estudiar las enfermedades cardiovasculares en modelos murinos.

En este estudio, a los ratones knockout se les inyectan dos sondas fluorescentes de infrarrojo cercano diferentes. Las aortas se extraen 24 horas después y se evalúan mediante imágenes NIRF. Los resultados muestran una respuesta significativa de NIRF, lo que indica la presencia de una calcificación extensa que se ubica junto con la acumulación de macrófagos.

Las imágenes NIRF también se pueden utilizar para localizar y evaluar tumores in vivo. En este estudio, se crea tejido que simula maniquíes mamarios que contienen inclusiones fluorescentes que simulan tumores. A continuación, se simulan las aplicaciones de las imágenes NIRF durante la cirugía de conservación de la mama.

Los resultados muestran que las inclusiones similares a tumores son detectables por NIRF hasta una profundidad de aproximadamente dos centímetros. Las inclusiones más profundas que esto son detectables después de que se hacen incisiones en el tejido fantasma superpuesto. Una vez que se extirpan las inclusiones, el cirujano evalúa las imágenes NIRF. Cualquier fluorescencia restante, que indica la presencia de tumores, indica una extirpación incompleta y luego se extirpa.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las imágenes de infrarrojo cercano. Ahora debe comprender los principios de la excitación y emisión de fluoróforos, cómo preparar a un animal para la obtención de imágenes NIRF in vivo y ex vivo, y algunas aplicaciones biomédicas. ¡Gracias por mirar!