Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

Este protocolo describe cómo realizar la tinción inmunohistoquímica en larvas de gsof disecadas para visualizar las proteínas involucradas en el desarrollo de la sinapsis. Se utiliza un tubo de 1,7 milésimas de pulgada durante todo el procedimiento para la incubación de anticuerpos primarios y secundarios, así como para los pasos de lavado. Luego, las larvas se transfieren a un portaobjetos de procesamiento, donde se recortan con un cuchillo exacto para ver las muestras y se mueven a una gota de reactivo antidecoloración.

En una guía de montaje, finalmente se sella un cubreobjetos a la guía con esmalte de uñas. Hola, soy Jonathan Brent del laboratorio de Brian McCade en el Departamento de Fisiología y Biofísica Celular del Colegio de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia. Utilizamos este procedimiento para estudiar la regulación genética de la formación de sinapsis en la unión neuromuscular y el desarrollo de un nódulo.

Así que comencemos. Antes de realizar la inmunohistoquímica en la larva de MJ, primero diseccione adecuadamente las larvas. Para aprender este procedimiento, vea el artículo de video adjunto titulado Disección de larvas de Drosophila N MJ.

Para comenzar el procedimiento, prepare tres soluciones frescas. Primero, haga la solución de PBT agregando detergente al PBS recién hecho. En segundo lugar, tome una alícuota de albúmina sérica bovina y agréguela a una solución de PBT.

Para hacer PBTB en tercer lugar, tome un suero de cabra aqua normal y agréguelo a la solución de PB TB para hacer la solución de PBTN. Después de preparar estas soluciones, transfiera las larvas a un tubo de 1.5 mil que contenga un mil PBT. Este es el primer lavado.

Cada lavado implica reemplazar la solución en la que se sumergen las larvas y luego incubar las larvas en un mezclador mutador que gira lentamente. No transfiera las larvas de un tubo a otro, ya que esto las dañará. Este primer lavado es de 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de 15 minutos de mezclar, reemplace el PBT con PBT fresco con una pipeta y lave las larvas durante otros 15 minutos. Al cambiar las soluciones de lavado, siempre tenga cuidado de evitar dañar las larvas cuando se completen los lavados de PBT. Lave las larvas en PBTB durante 30 minutos.

Repita este lavado con solución fresca durante otros 30 minutos. Con el PBTB el lavado es completo. Lave dos veces con PBTN durante 15 minutos por lavado.

Durante el segundo paso de lavado, el anticuerpo primario se puede diluir en PBTN a la concentración de trabajo deseada. Después del lavado, incubar las larvas en esta mezcla de anticuerpos durante una hora con una mezcla suave a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Cuando se complete la incubación, extraiga la solución de anticuerpos primarios y enjuague rápidamente las larvas con PBTB varias veces para eliminar cualquier anticuerpo restante.

Para preparar las larvas para la siguiente incubación de anticuerpos, lávelas una vez en PBTB durante 15 minutos y lávelas dos veces con PBTN durante 30 minutos. Diluir el anticuerpo secundario en PBTN a la concentración de trabajo deseada e incubar las larvas en esta mezcla durante una hora y media. A temperatura ambiente, asegúrese de cubrir las larvas para evitar la exposición a la luz y minimizar el blanqueo del piso cuatro.

Después de una hora y media, retire la solución de anticuerpos secundarios y enjuague las larvas varias veces más en PBTB. Ahora, lave las larvas en PBTV durante 15 minutos dos veces. Todo el resto del lavado y almacenamiento de las larvas debe realizarse con una exposición mínima a la luz, así que asegúrese de mantenerlas cubiertas.

Transfiera las larvas del tubo de 1.5 mil a PBT en un portaobjetos de procesamiento de vidrio. Las larvas ya están listas para el montaje para montar las larvas teñidas en una solución de oro prolongada en un baño de agua a 65 grados centígrados durante dos o tres minutos. Luego tome un Eloqua y manténgalo en un bloque de calor establecido a 50 grados centígrados.

Aplique un poco de PB TB a una diapositiva de procesamiento. Transfiera las larvas a la PB tb. Gire las larvas para que queden con la cutícula hacia abajo con un cuchillo exacto con la hoja número 16, recorte la cabeza y la cola de las larvas.

También puedes usar una navaja de afeitar para este paso. Ahora prepare la corredera de montaje en una corredera limpia a 40 microlitros de oro prolongado de la alícuota calentada y extiéndala con pinzas limpias. Uso de fórceps.

Transfiera con cuidado de seis a ocho de las larvas preparadas del portaobjetos de procesamiento al portaobjetos de montaje. Trate de mantenerlos en la misma orientación y mantenga los lados de la cutícula hacia abajo para montar las larvas. Coloque un cubreobjetos sobre la solución prolongada.

Colóquelo en un borde en la periferia de la piscina prolongada y deje caer con cuidado el deslizamiento para cubrir las muestras. Sella los bordes de la cubierta a la corredera con tu color favorito de esmalte de uñas espeso y barato. Deje que el portaobjetos se seque durante un mínimo de tres horas.

Si los portaobjetos se van a visualizar una sola vez e inmediatamente después de la preparación, entonces la solución de oro prolongada puede sustituirse por glicerol. Luego, el tiempo de secado del esmalte de uñas y el glicerol es de solo unos 10 minutos, en comparación con las tres horas con cualquier protocolo de tinción. El objetivo es una señal específica alta combinada con un fondo bajo.

Esto se logra mediante el uso de anticuerpos de alta calidad y realizando minuciosamente los pasos de bloqueo y lavado. Estas imágenes muestran sinapsis de tipo salvaje, así como las de una cepa de mosca que expresa un receptor BMP de tipo dos mutado, conocido como el mutante de la ilusión o la bruja. La membrana neuronal está teñida de azul con un anticuerpo contra la peroxidasa de rábano picante.

Las vesículas sinápticas que se muestran en rojo están teñidas con anticuerpos antisinápticos. La post sinapsis que se muestra en verde está teñida con anticuerpos contra discos grandes. Estos resultados mostraron que la mutación del receptor BMP tipo dos produce un fenotipo de sotobosque sináptico.

Este mutante fue clave en el establecimiento de las BMP como señales retrógradas que regulan el número de butones terminales sinápticos. Acabamos de mostrarte cómo realizar la inmunohistoquímica en la unión neuromuscular de una larva esófago. Al realizar este procedimiento.

Es importante ejecutar el procedimiento en el momento adecuado para garantizar la máxima reproducibilidad y un bajo fondo. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.