Name: Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende inmunohistoquímica en larvas de Drosophila para visualizar proteínas en la unión neuromuscular. Este método permite estudiar la regulación genética del desarrollo sináptico en neurociencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Antes de empezar <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: PBT (0,1% Triton X100 en PBS 1X), PBTB (0,2% de BSA en PBT), y PBTN (NGS 2% en PBTB). </li><li> Diseccionar las larvas de Drosophila. Por favor vea las larvas de Drosophila disección NMJ. </li></ol> Inmunohistoquímica <ol><li> Mueva las larvas de un tubo de 1.5 ml contiene PBT. Lavado de las larvas de dos veces durante 15 minutos en el PBT. Nota: para lavar, se coloca el tubo de 1.5 ml en un mezclador nutator. Quite el líquido con una pippetor y reemplazarlo con líquido fresco. </li><li> Retire el PBT. Lavar dos veces en PBTB durante 30 minutos. </li><li> Retire la PBTB. Lavar dos veces en PBTN durante 15 minutos. </li><li> Se incuban en anticuerpo primario diluido en PBTN a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 º C durante la noche. </li><li> Aclarar dos veces con PBTB. Nota: para la solución de enjuague agregar y quitar rápidamente. </li><li> Lavar dos veces durante 15 minutos en PBTB. </li><li> Lave en PBTN durante 30 minutos. </li><li> Se incuban en anticuerpo secundario (anticuerpo conjugado primaria y si usted está usando una) diluido en PBTN. </li><li> Cubierta en papel de aluminio e incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar dos veces con PBTB. </li><li> Lavar dos veces durante 15 minutos con PBTB. </li><li> Proceder al montaje. </li></ol> Montaje Nota: Monte en glicerol si las muestras se creará una imagen de inmediato. Monte de Oro prolongar si las muestras se almacenan antes de exponer (por más de una semana) o si las muestras deben ser reflejados en múltiples ocasiones. Para utilizarlo, coloque una botella de prolongar en el 65 º baño de agua C durante 2-3 minutos. Tomar una alícuota de prolongar Oro y mantenerse en calor en un bloque a 45-50 º C. <ol><li> Vierta preparaciones teñidas en PBT en un vidrio de reloj. </li><li> Ponga un poco de glicerina en un portaobjetos de vidrio limpio para su procesamiento. </li><li> Trasladar a los animales para deslizar el procesamiento por recogerlos del vidrio de reloj en una esquina con unas pinzas. Asegurarse de que están de lado la cutícula hacia abajo. </li><li> Quitar la cabeza y la cola con una hojita de afeitar nueva en el portaobjetos de vidrio procesado. Un exacto cuchillo con la hoja n. º 16 funciona bien para esto. </li><li> En otra diapositiva (slide de montaje), poner una pequeña gota de glicerol / prolongar y extender con pinzas limpias. </li><li> Trasladar a los animales disecados de la diapositiva de montaje en su borde, teniendo cuidado de no invertir. Intente montarlos en las filas de la misma orientación. Monte 8.6 animales por diapositiva. </li><li> Caída de una hoja de cubierta mediante la colocación de una ventaja en el glicerol / Prolongar y poco a poco la liberación. </li><li> Sello de la diapositiva con esmalte de uñas. [Nota No imagen hasta que el barniz se seca. Esto suele tardar diez minutos. Para las muestras montadas en prolongar oro, que las diapositivas se seque por lo menos tres horas antes de sellar o de imagen.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Inmunohistoquímica (IHC) es de vital importancia para el estudio de la biología MNJ, ya que permite la visualización de la UNM. Esto se logra mediante el uso de anticuerpos que reconocen la membrana neuronal (por ejemplo, HRP), la presynapse (por ejemplo, CSP, SYT), y / o la postsynapse (por ejemplo, DLG). Moléculas de señalización, las proteínas estructurales, o de nuevas proteínas de interés también puede ser manchada. Entonces, los genes pueden mutar o missexpressed y IHC puede detectar la perturbación de la estructu...

<table><tbody><tr><td>Stereo microscopio &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutatorio Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de precisión n.º 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas n.º 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larval nmj inmunohistoquímica

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Unión neuromuscular (UNM) es un sistema modelo establecido utilizado para el estudio del desarrollo sináptico y su plasticidad. El uso generalizado de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor del sistema se debe a su gran accesibilidad. Se puede analizar con una sola célula de resolución. Hay 30 músculos por hemisegment cuya disposición dentro de la pared del cuerpo periférico se conocen. Un total de 31 neuronas motoras se adhieren a estos músculos en un patrón que tiene una alta fidelidad. Utilizando la biología molecular y la genética, se puede crear animales transgénicos o mutantes. Entonces, se puede estudiar las consecuencias del desarrollo sobre la morfología y función de la UNM. La inmunohistoquímica puede ser usado para la imagen con claridad los componentes de la UNM. En este artículo se muestra cómo utilizar la tinción de anticuerpos para visualizar el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval NMJ.

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

La unión neuromuscular (UNM) de Drosophila es un sistema modelo establecido que se utiliza para el estudio del desarrollo y la plasticidad sinápticos. El uso generalizado...

Este protocolo describe cómo realizar tinción inmunohistoquímica en larvas de gsof diseccionadas para visualizar proteínas implicadas en el desarrollo de sinapsis. A lo largo del procedimiento se utiliza un tubo de 1.7 mil para la incubación con los anticuerpos primario y secundario, así como para los pasos de lavado. Luego, las larvas se transfieren a una portaobjetos de procesamiento donde se recortan con una cuchilla exacto; a continuación, los especímenes para observación se mueven a una gota de reactivo antifade.En un portaobjetos para montaje, un cubreobjetos se sella finalmente al porta con esmalte de uñas. Hola, soy Jonathan Brent del laboratorio de Brian McCade en el Departamento de Fisiología y Biofísica Celular de la Facultad de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia. Utilizamos este procedimiento para estudiar la regulación genética de la formación de sinapsis en la unión neuromuscular y en el nodo en desarrollo.Así que comencemos. Antes de realizar inmunohistoquímica en la larva de gsof n MJ, primero debes diseccionar adecuadamente las larvas. Para aprender este procedimiento, mira el artículo en video adjunto titulado Drosophila Larva N MJ Dissection.Para c

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Drosophila larval NMJ Disección

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Arborización dendrítica de las neuronas sensoriales de...

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

Para entender cómo las formas complejas de células, como las dendritas neuronales, se obtienen durante el desarrollo, es importante ser capaz de precisión organización de microtúbulos ensayo. Aquí se describe un método robusto de etiquetado inmunohistoquímico para examinar la organización de microtúbulos de las dendritas arborización dendrítica neurona sensorial, la tráquea, músculos y...

Etiquetado inmunohistológica de microtúbulos en las dendritas neurona sensorial, tráqueas y los músculos en el Drosophila Larva pared del cuerpo

La unión neuromuscular de Drosophila (NMJ) se utiliza como modelo para estudiar la morfología y función de las sinapsis. Este video describe características importantes que los investigadores cuantifican para caracterizar el NMJ. El protocolo de ejemplo muestra un software capaz de realizar la cuantificación automáticamente.

Drosophila Cuantificación de la unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología y la función sináptica

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

La morfología, el tamaño y la ubicación de los orgánulos intracelulares se conservan evolutivamente y parecen afectar directamente a su función. Comprender los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos se ha convertido en un objetivo importante de la biología moderna. Aquí mostramos cómo estos estudios pueden ser facilitados por la aplicación de técnicas cuantitativas.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Este informe proporciona un nuevo procedimiento de preparación de muestras para visualizar las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila . Este método es más eficaz para evitar el enroscamiento de las muestras en comparación con el método tradicional y es particularmente útil para el análisis ultraestructural de la unión neuromuscular de Drosophila .

Optimización del proceso de preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión de uniones neuromusculares en larvas de Drosophila

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Aprende inmunohistoquímica en larvas de Drosophila para visualizar proteínas en la unión neuromuscular. Este método permite estudiar la regulación genética del desarrollo sináptico en neurociencia.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

Explorar más videos