Name: Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende inmunohistoquímica en larvas de Drosophila para visualizar proteínas en la unión neuromuscular. Este método permite estudiar la regulación genética del desarrollo sináptico en neurociencia.

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Antes de empezar <ol><li> Prepare las siguientes soluciones: PBT (0,1% Triton X100 en PBS 1X), PBTB (0,2% de BSA en PBT), y PBTN (NGS 2% en PBTB). </li><li> Diseccionar las larvas de Drosophila. Por favor vea las larvas de Drosophila disección NMJ. </li></ol> Inmunohistoquímica <ol><li> Mueva las larvas de un tubo de 1.5 ml contiene PBT. Lavado de las larvas de dos veces durante 15 minutos en el PBT. Nota: para lavar, se coloca el tubo de 1.5 ml en un mezclador nutator. Quite el líquido con una pippetor y reemplazarlo con líquido fresco. </li><li> Retire el PBT. Lavar dos veces en PBTB durante 30 minutos. </li><li> Retire la PBTB. Lavar dos veces en PBTN durante 15 minutos. </li><li> Se incuban en anticuerpo primario diluido en PBTN a temperatura ambiente durante 1 hora o menos 4 º C durante la noche. </li><li> Aclarar dos veces con PBTB. Nota: para la solución de enjuague agregar y quitar rápidamente. </li><li> Lavar dos veces durante 15 minutos en PBTB. </li><li> Lave en PBTN durante 30 minutos. </li><li> Se incuban en anticuerpo secundario (anticuerpo conjugado primaria y si usted está usando una) diluido en PBTN. </li><li> Cubierta en papel de aluminio e incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente. </li><li> Aclarar dos veces con PBTB. </li><li> Lavar dos veces durante 15 minutos con PBTB. </li><li> Proceder al montaje. </li></ol> Montaje Nota: Monte en glicerol si las muestras se creará una imagen de inmediato. Monte de Oro prolongar si las muestras se almacenan antes de exponer (por más de una semana) o si las muestras deben ser reflejados en múltiples ocasiones. Para utilizarlo, coloque una botella de prolongar en el 65 º baño de agua C durante 2-3 minutos. Tomar una alícuota de prolongar Oro y mantenerse en calor en un bloque a 45-50 º C. <ol><li> Vierta preparaciones teñidas en PBT en un vidrio de reloj. </li><li> Ponga un poco de glicerina en un portaobjetos de vidrio limpio para su procesamiento. </li><li> Trasladar a los animales para deslizar el procesamiento por recogerlos del vidrio de reloj en una esquina con unas pinzas. Asegurarse de que están de lado la cutícula hacia abajo. </li><li> Quitar la cabeza y la cola con una hojita de afeitar nueva en el portaobjetos de vidrio procesado. Un exacto cuchillo con la hoja n. º 16 funciona bien para esto. </li><li> En otra diapositiva (slide de montaje), poner una pequeña gota de glicerol / prolongar y extender con pinzas limpias. </li><li> Trasladar a los animales disecados de la diapositiva de montaje en su borde, teniendo cuidado de no invertir. Intente montarlos en las filas de la misma orientación. Monte 8.6 animales por diapositiva. </li><li> Caída de una hoja de cubierta mediante la colocación de una ventaja en el glicerol / Prolongar y poco a poco la liberación. </li><li> Sello de la diapositiva con esmalte de uñas. [Nota No imagen hasta que el barniz se seca. Esto suele tardar diez minutos. Para las muestras montadas en prolongar oro, que las diapositivas se seque por lo menos tres horas antes de sellar o de imagen.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Inmunohistoquímica (IHC) es de vital importancia para el estudio de la biología MNJ, ya que permite la visualización de la UNM. Esto se logra mediante el uso de anticuerpos que reconocen la membrana neuronal (por ejemplo, HRP), la presynapse (por ejemplo, CSP, SYT), y / o la postsynapse (por ejemplo, DLG). Moléculas de señalización, las proteínas estructurales, o de nuevas proteínas de interés también puede ser manchada. Entonces, los genes pueden mutar o missexpressed y IHC puede detectar la perturbación de la estructu...

<table><tbody><tr><td>Stereo microscopio &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont n.º 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador nutatorio Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de precisión n.º 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas n.º 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo antifade ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larval nmj inmunohistoquímica

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Unión neuromuscular (UNM) es un sistema modelo establecido utilizado para el estudio del desarrollo sináptico y su plasticidad. El uso generalizado de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor del sistema se debe a su gran accesibilidad. Se puede analizar con una sola célula de resolución. Hay 30 músculos por hemisegment cuya disposición dentro de la pared del cuerpo periférico se conocen. Un total de 31 neuronas motoras se adhieren a estos músculos en un patrón que tiene una alta fidelidad. Utilizando la biología molecular y la genética, se puede crear animales transgénicos o mutantes. Entonces, se puede estudiar las consecuencias del desarrollo sobre la morfología y función de la UNM. La inmunohistoquímica puede ser usado para la imagen con claridad los componentes de la UNM. En este artículo se muestra cómo utilizar la tinción de anticuerpos para visualizar el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval NMJ.

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

La unión neuromuscular (UNM) de Drosophila es un sistema modelo establecido que se utiliza para el estudio del desarrollo y la plasticidad sinápticos. El uso generalizado...

Este protocolo describe cómo realizar tinción inmunohistoquímica en larvas de gsof diseccionadas para visualizar proteínas implicadas en el desarrollo de sinapsis. A lo largo del procedimiento se utiliza un tubo de 1.7 mil para la incubación con los anticuerpos primario y secundario, así como para los pasos de lavado. Luego, las larvas se transfieren a una portaobjetos de procesamiento donde se recortan con una cuchilla exacto; a continuación, los especímenes para observación se mueven a una gota de reactivo antifade.En un portaobjetos para montaje, un cubreobjetos se sella finalmente al porta con esmalte de uñas. Hola, soy Jonathan Brent del laboratorio de Brian McCade en el Departamento de Fisiología y Biofísica Celular de la Facultad de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia. Utilizamos este procedimiento para estudiar la regulación genética de la formación de sinapsis en la unión neuromuscular y en el nodo en desarrollo.Así que comencemos. Antes de realizar inmunohistoquímica en la larva de gsof n MJ, primero debes diseccionar adecuadamente las larvas. Para aprender este procedimiento, mira el artículo en video adjunto titulado Drosophila Larva N MJ Dissection.Para comenzar el procedimiento, prepare tres soluciones frescas. En primer lugar, prepare la solución de PBT añadiendo detergente al PBS recién preparado. En segundo lugar, tome una alícuota de albúmina de suero bovino y añádala a una solución de PBT.Para preparar PBTB tercero, tome suero de cabra normal acuoso y añádalo a la solución PB TB para obtener la solución PBTN. Después de preparar estas soluciones, transfiera las larvas a un tubo de 1,5 ml que contenga 1 ml de PBT. Este es el primer lavado.Cada lavado consiste en reemplazar la solución en la que están sumergidas las larvas y luego incubar las larvas en un mezclador rotatorio lento. No transfiera las larvas de un tubo a otro, ya que esto las dañaría. Este primer lavado dura 15 minutos a temperatura ambiente.Tras 15 minutos de mezcla, reemplace el PBT con PBT fresco utilizando una pipeta y lave las larvas durante otros 15 minutos. Al intercambiar las soluciones de lavado, tenga siempre cuidado de evitar dañar las larvas. Cuando los lavados con PBT estén completos, lave las larvas en PBTB durante 30 minutos.Repita este lavado con solución fresca durante otros 30 minutos. Con el PBTB, el lavado está completo. Lave dos veces con PBTN durante 15 minutos por cada lavado.Durante el segundo paso de lavado, el anticuerpo primario puede diluirse en PBTN a la concentración de trabajo deseada. Después del lavado, incubar las larvas en esta mezcla de anticuerpos durante una hora con mezcla suave a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Cuando finalice la incubación, aspirar la solución de anticuerpo primario y enjuagar rápidamente las larvas varias veces con PBTB para eliminar cualquier anticuerpo residual.Para preparar las larvas para la siguiente incubación con anticuerpo, lávelas una vez con PBTB durante 15 minutos y luego dos veces con PBTN durante 30 minutos cada vez. Diluya el anticuerpo secundario en PBTN a la concentración de trabajo deseada e incube las larvas en esta mezcla durante una hora y media. A temperatura ambiente, asegúrese de cubrir las larvas para evitar la exposición a la luz y minimizar el blanqueo del fluoróforo cuatro.Después de una hora y media, retire la solución de anticuerpo secundario y enjuague las larvas varias veces más en PBTB. Ahora, lave las larvas en PBTV durante 15 minutos, dos veces. Todo el lavado restante y el almacenamiento de las larvas deben realizarse con exposición mínima a la luz, por lo que asegúrese de mantenerlas cubiertas.Transfiera las larvas desde el tubo de 1,5 ml al PBT en una placa de procesamiento de vidrio. Las larvas ya están listas para el montaje; monte las larvas teñidas en solución de Gold prolongada al calor en un baño de agua a 65 grados Celsius durante dos o tres minutos. Luego tome un Eloqua y colóquelo en un bloque térmico ajustado a 50 grados Celsius.Aplique algo de PB TB sobre un portaobjetos para procesamiento. Transfiera las larvas al PB TB. Gire las larvas para que queden con la cutícula hacia abajo utilizando un bisturí con hoja número 16, y corte las cabezas y colas de las larvas.También puede utilizar una cuchilla para este paso. Ahora prepare el portaobjetos de montaje colocando en un portaobjetos limpio 40 microlitros de oro prolongado del alícuota calentado y extiéndalo con pinzas limpias. Utilizando pinzas.Transfiera cuidadosamente de seis a ocho larvas preparadas desde la placa de procesamiento hasta la placa de montaje. Trate de mantenerlas en la misma orientación y con sus cutículas hacia abajo para montar las larvas. Coloque una cubreobjetos sobre la solución prolongada.Colóquelo en un borde en la periferia del charco alargado y deje caer cuidadosamente el cubreobjetos para cubrir las muestras. Selle los bordes del cubreobjetos al portaobjetos con su esmalte de uñas grueso y económico del color que prefiera. Deje secar el portaobjetos durante un mínimo de tres horas.Si las láminas se van a observar solo una vez y de inmediato después de su preparación, entonces la solución de oro prolongada puede sustituirse por glicerol. Entonces, el tiempo de secado del esmalte de uñas y del glicerol es de solo unos 10 minutos, a diferencia de las tres horas requeridas con cualquier protocolo de tinción. El objetivo es obtener una señal específica alta combinada con un fondo bajo.Esto se logra utilizando anticuerpos de alta calidad y realizando minuciosamente los pasos de bloqueo y lavado. Estas imágenes muestran sinapsis de tipo silvestre, así como sinapsis de una cepa de mosca que expresa un receptor BMP tipo dos mutado, conocido como el mutante *wishful thinking* o *witch*. La membrana neuronal se tiñe de azul con un anticuerpo contra la peroxidasa de rábano picante.Las vesículas sinápticas mostradas en rojo están teñidas con anticuerpo antisináptico. La sinapsis postsináptica mostrada en verde está teñida con anticuerpo contra discs large. Estos resultados mostraron que la mutación del receptor BMP tipo dos wit produce un fenotipo de hipocrecimiento sináptico.Este mutante fue fundamental para establecer a las BMP como señales retrogradas que regulan el número de botones terminales sinápticos. Acabamos de mostrarle cómo realizar inmunohistoquímica en una unión neuromuscular larval del esófago. Al realizar este procedimiento.Es importante realizar el procedimiento con la temporización adecuada para garantizar una reproducibilidad máxima y un fondo bajo. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

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La morfología, el tamaño y la ubicación de los orgánulos intracelulares se conservan evolutivamente y parecen afectar directamente a su función. Comprender los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos se ha convertido en un objetivo importante de la biología moderna. Aquí mostramos cómo estos estudios pueden ser facilitados por la aplicación de técnicas cuantitativas.

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Aprende inmunohistoquímica en larvas de Drosophila para visualizar proteínas en la unión neuromuscular. Este método permite estudiar la regulación genética del desarrollo sináptico en neurociencia.

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