Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3

Hola, soy Judy Y del laboratorio de Kate Rubins en el Instituto Whitehead de Investigación Biomédica. Aquí demostramos cómo etiquetar las muestras de ARN antisentido recolectadas tanto de las células hela infectadas con el virus vaccinia como del virus mediante el acoplamiento de colorantes amino todo LEO. A continuación, mostramos cómo limpiar el ARN A marcado y prepararlo para ser hibridado para el análisis de microarrays de la expresión génica.

Los videos anteriores de Joe destacan cómo realizar las infecciones virales, el aislamiento de ARN total y los pasos de amplificación y amplificación de ARN. Así que comencemos. Para comenzar un etiquetado de ARN, primero agregue un microgramo de las muestras de ARN A en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Seque las muestras al vacío a fuego lento o sin calor hasta que estén completamente secas. Tape cada tubo tan pronto como esté seco. Es importante no secar demasiado las muestras después de que se hayan secado.

Agregue un tampón de acoplamiento de nueve microlitros a cada tubo y vuelva a suspender el ARN A mediante un vórtice suave durante un minuto, centrifugar brevemente para recolectar la muestra en el fondo del tubo y luego dejar que la muestra se asiente en hielo. A continuación, agregue 22 microlitros de DMSO de alta calidad a cada tubo de tinte SCI tres o S cinco, un tubo de tinte es suficiente para dos muestras. El S SI de tres troqueles para etiquetar sus muestras de referencia y el tinte SCI de cinco es para etiquetar sus muestras de prueba.

Agita los tintes para mezclarlos bien. Recuerda mantener los tintes en la oscuridad hasta que estén listos para usar. No prepare el tinte antes de una hora antes de usarlo y asegúrese de que no entre agua en la mezcla de tinte DMSO en ningún momento.

Ahora a 11 microlitros de la mezcla de colorante D-M-S-O-S preparada a cada muestra mezclada bien por vórtice. Incube suavemente durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Cubra las muestras con papel de aluminio o guárdelas en un cajón para minimizar la exposición a la luz.

Después de la incubación a 4,5 microlitros hidroxilamina a cada muestra para apagar la reacción mezclada bien por vórtice. Incube suavemente durante otros 15 minutos a temperatura de escoba. Cubra las muestras con papel de aluminio o guárdelas en un cajón para minimizar la exposición a la luz.

Para limpiar la etiqueta, utilizan el vórtice de ARN, las perlas de unión al ARN. Brevemente, para obtener una mezcla uniforme antes de usar, prepare la mezcla de unión al ARN A a temperatura ambiente. Mezcle bien la mezcla de unión mediante vórtice alícuota del tampón de elución de ARN A en un tubo de 1,5 mililitros e incube de 50 a 60 grados centígrados durante al menos 10 minutos.

Agregue 70 microlitros de la mezcla de unión de ARN A a cada muestra y mezcle bien por tubería sumando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces después de mezclar, transfiera las muestras de la placa de PCR a una placa inferior redonda de 96 pocillos. A continuación, agregue 50 microlitros de isopropanol al cien por cien a cada muestra y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces. Agite suavemente la placa en un agitador orbital durante al menos dos minutos.

Para mezclar bien las muestras. Mueva la placa a un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas.

Deje el plato en el soporte hasta que la mezcla se vuelva transparente y las cuentas de unión se hayan granulado. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar las perlas magnéticas. Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante.

El sobrenadante debe ser de un rosa brillante o un azul brillante en este punto debido a las moléculas de tinte no incorporadas. Una vez que se haya desechado el sobrenadante, retire la placa del soporte magnético. Ahora agregue cien microlitros, una solución de lavado de ARN a cada pocillo y agite la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad moderada.

Es posible que las cuentas no se dispersen completamente en este paso, regrese la placa a un soporte magnético. Para capturar las perlas magnéticas. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar las perlas magnéticas.

Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante. Retire la placa del soporte magnético. Repita el lavado por segunda vez con 100 microlitros, una solución de lavado de ARN.

Después del segundo lavado. Seque las perlas agitando la placa durante un minuto en el agitador orbital a la velocidad máxima. No seque en exceso las muestras que eluyen el ARN A de las perlas añadiendo 20 microlitros precalentados, tampón de elución de ARN A.

A cada muestra, agite enérgicamente la placa del agitador orbital durante tres minutos. A continuación, comprueba que las perlas magnéticas están completamente dispersas. Si no es así, sigue temblando.

Una vez que las cuentas magnéticas estén completamente dispersas, mueva la placa a un soporte magnético para capturar las cuentas magnéticas. El sobrenadante contiene las muestras de ARN A etiquetadas limpias y debe ser de color rosa pálido o azul pálido. A continuación, transfiera cuidadosamente el ARN aludido a una nueva placa de PCR o tubos de PCR.

En este punto, puede comprobar la concentración de ARN y la cantidad de colorante en las muestras midiendo 1,5 microlitros en un espectrofotómetro NanoDrop. Usando el módulo de microarrays, hibrida inmediatamente el ARN A marcado en una plataforma de microarrays de su elección. O alternativamente, puede almacenar el ARN A marcado a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para la hibridación.

Se trata de una lectura representativa del espectrofotómetro y un gráfico de diámetro exterior generado con el espectrofotómetro NanoDrop para medir la concentración de muestras y la incorporación de colorantes. Puede ver los picos de OD a 260 nanómetros para calcular la concentración de las muestras, así como los dos picos de alrededor de 532 y 635 nanómetros que representan los cinco tintes S3 y SCI respectivamente. Acabamos de mostrarle cómo marcar con fluorescencia muestras de ARN incorporadas a alelos inmunológicos amplificados para la hibridación de microrayos.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar volver a suspender el tinte en DMSO menos de una hora antes del acoplamiento y asegurarse de que no entre agua en la mezcla de DMSO, ya que reaccionará con el grupo activo del tinte. También es importante recordar que no se debe secar demasiado el ARN si es necesario. Las muestras se pueden secar hasta uno o dos microlitros en lugar de secarse por completo, y luego resuspenderse bien en el tampón de acoplamiento durante la reacción de acoplamiento.

Mantenga las reacciones en la oscuridad con movimientos ocasionales y gire hacia abajo si lo desea. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.

Asegúrese de ver los otros videos de esta serie donde mostramos cómo realizar una infección de curso de tiempo con el virus vaccinia y la extracción de ARN de las muestras y el procedimiento para la amplificación lineal de muestras de ARN.