Name: Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende a marcar ARN antisentido de células HeLa infectadas con virus vaccinia mediante acoplamiento aminoalilo de colorantes. Este método prepara muestras para análisis de microarrays y estudio de expresión génica viral.

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Los becarios del Instituto Whitehead Fondos

Parte 1: ARNA etiquetado: acoplamiento de alilo amino de los tintes <ol><li> Añadir 1 g de las muestras en tubos de microcentrífuga ARNA 1,5 ml. </li><li> De vacío seca las muestras a fuego lento o no hasta que estén completamente secos. Cap cada tubo tan pronto como esté seca - no resecar! </li><li> Añadir 9μl buffer de acoplamiento para cada tubo el ARNA suavemente vortex durante 1 minuto. Centrifugar brevemente para recoger la muestra en la parte inferior del tubo, y luego dejar que la muestra se sientan en el hielo. </li><li> Añadir DMSO 22μl de alta calidad a cada tubo de Cy3 o Cy5 tinte. Un tubo de tinte es suficiente para dos muestras. El tinte Cy3 es para el etiquetado de las muestras de referencia, y el tinte Cy5 es para el etiquetado de las muestras de prueba. </li><li> Vortex los tintes para mezclar a fondo. Mantenga los tintes en la oscuridad hasta que esté listo para su uso. No prepare tinte antes de 1 hora antes de usar. Asegúrese de que no entra agua en la mezcla de tinte / DMSO en cualquier momento. </li><li> Añadir 11μl de los preparados DMSO / Cy medio de contraste para cada muestra. Mezclar bien por agitación suave. </li><li> Incubar durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Cubrir las muestras con papel de aluminio o de permanecer en un cajón para minimizar la exposición a la luz. </li><li> Después de la incubación, añadir 4.5μl hydroxlyamine a cada muestra para detener la reacción. Mezclar bien por agitación suave. </li><li> Incubar durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Cubrir las muestras con papel de aluminio o de permanecer en un cajón para minimizar la exposición a la luz. </li></ol> Parte 2: Etiquetado ARNA limpieza <ol><li> Vortex las cuentas de unión a ARN brevemente para obtener una mezcla homogénea antes de su uso. </li><li> Prepare la mezcla ARNA unión a temperatura ambiente. (Tabla 1) </li><li> Mezclar bien por agitación. </li><li> Alícuotas del tampón de elución ARNA en un tubo de 1,5 ml y se incuba a 50-60 ° C durante al menos 10 minutos. </li><li> Añadir 70μl de la mezcla de ARNA vinculante para cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Transferencia de las muestras de la placa de PCR a una de 96 pozos de fondo redondo de la placa. </li><li> Añadir 50μl de 100% de isopropanol a cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces. </li><li> Agitar suavemente la placa en un agitador orbital durante por lo menos 2 minutos para mezclar bien las muestras. </li><li> Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. Dejar la placa en el soporte hasta que la mezcla se vuelve transparente y las cuentas de enlace tienen gránulos. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. El sobrenadante debe ser de un color rosa brillante o un azul brillante en este momento debido a las moléculas de colorante no incorporado. </li><li> Retire la placa del soporte magnético. </li><li> Agregar 100μl solución de lavado ARNA a cada pocillo y agitar la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a una velocidad moderada. Cuentas puede no dispersarse en este paso. </li><li> Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. </li><li> Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante. </li><li> Retire la placa del soporte magnético. </li><li> Repita el lavado de un tiempo de 2 ª con la solución de lavado 100μl ARNA. </li><li> Después del lavado 2 º, seca los granos al sacudir la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a la velocidad máxima. No resecar las muestras! </li><li> Eluir el ARNA de las cuentas mediante la adición de 20μl Buffer precalentado elución ARNA a cada muestra. </li><li> Agite la placa para la placa en un agitador orbital durante 3 minutos, a continuación, comprobar para asegurarse de que los granos magnéticos son totalmente dispersos. Si no, continuar agitando. </li><li> Una vez que las partículas magnéticas se han dispersado totalmente, mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. El sobrenadante contiene el limpiado, etiquetados muestras Arna, y debe ser un color rosa pálido o azul pálido. </li><li> Transferir cuidadosamente la ARNA eluye a una nueva placa de PCR (o los tubos de PCR). </li><li> (Paso opcional) Comprobar la concentración de ARN y la cantidad de colorante en las muestras mediante la medición en un espectrofotómetro 1.5μl NanoDrop utilizando el módulo de microarrays. </li><li> Inmediatamente hibridar el ARNA etiquetados en una plataforma de microarrays de su elección, o, alternativamente, puede almacenar el ARNA etiquetados a -80 ° C hasta que esté listo para la hibridación. </li></ol> Tabla 1 ARNA unión Mix <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Importe para una reacción </td></tr><tr><td> * Cuentas de unión a ARN </td><td> 10μl </td></tr><tr><td> Resuspensión de bolas * Solución </td><td> 4μl </td></tr><tr><td> 100% de isopropanol ** </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> ARNA Concentrado tampón de unión </td><td> 50μl </td></tr></tbody></table> * Mezclar los granos de unión a ARN con elcordón de solución de resuspensión primero ** Agregue el isopropanol y mezclar bien antes de añadir el concentrado de tampón de unión ARNA.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos Al realizar el acoplamiento de alilo amino, es muy importante para volver a suspender el tinte en DMSO en breve (menos de 1 hora) antes del acoplamiento y asegurarse de que no entra agua en la mezcla de tinta / DMSO, ya que reacciona con el grupo activo en el medio de contraste. No resecar el ARN (se puede secar a 1-2UL en lugar de secar por completo), y resuspender bien en el tampón de acoplamiento. Durante la reacción de acoplamiento, que la reacción en la oscuridad, con e...

<table><tbody><tr><td>Paquete de colorantes reactivos tras el marcado CyDye</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN5661</td><td>Contiene los colorantes Cy3 y Cy5</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 UV-VIS</td><td>Otro</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>O espectrofotómetro equivalente</td></tr></tbody></table>

infección por el virus vaccinia y análisis temporal de la expresión génica del virus: parte 3

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

La familia<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compone de grandes de doble cadena de ADN que contienen los virus que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de la<em&gt; Orthopox</em&gt; Género incluyen la viruela, el agente causante de la viruela humana, viruela de los monos, y la vaccinia (VAC), el miembro prototípico de la familia del virus. En el genoma relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia, tres clases de genes están codificados: temprana, intermedia y tardía. Mientras que las tres clases son transcritos por la forma viral codificada ARN polimerasas, cada clase tiene una función diferente en el ciclo de vida del virus. Poxvirus utilizar múltiples estrategias para la modulación del ambiente celular del huésped durante la infección. Con el fin de entender la regulación de host y la expresión de genes del virus, hemos utilizado todo el genoma enfoques para analizar la abundancia de transcripción de los dos virus y las células huésped. Aquí, demostramos las infecciones tiempo del curso de las células HeLa con virus de la vacuna y el ARN de muestreo en varios puntos temporales después de la infección. Tanto del huésped como del ARN viral total es aislado y amplificado por la hibridación de microarrays para el análisis de la expresión génica.

Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales. Parte 3 describe el proceso de etiquetado fluorescente del ARN amplificado de host y de muestras de virus mediante el acoplamiento de aminoácidos de alilo de los colorantes.

Infección por el virus vaccinia y Análisis temporal de la expresión génica del virus: Parte 3

La familia Poxviridae consiste en virus grandes que contienen ADN de doble cadena y que se replican exclusivamente en el citoplasma de las células infectadas. Los miembros de...

Hola, soy Judy Y del laboratorio de Kate Rubins en el Instituto Whitehead para la Investigación Biomédica. Aquí demostramos cómo etiquetar las muestras de ARN antisentido recolectadas tanto de células HeLa infectadas con el virus vaccinia como del virus, mediante el acoplamiento de colorantes con amino all LEO. Luego mostramos cómo purificar el ARN etiquetado y prepararlo para hibridación en el análisis de expresión génica mediante microarreglos.En videos anteriores de JoVE se destaca cómo realizar el aislamiento de ARN total, la amplificación del ARN y los pasos de amplificación tras infecciones virales. Comencemos. Para iniciar la etiquetación del ARN, agregue primero un microgramo de las muestras de ARN A en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros.Seque los muestras al vacío con calor bajo o nulo hasta que estén completamente secas. Tape cada tubo tan pronto como esté seco. Es importante no sobresecar las muestras después de que se hayan secado.Agregue nueve microlitros de tampón de acoplamiento a cada tubo y resuspenda el ARN A mediante vortex agitación suave durante un minuto; centrifugue brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo y luego deje la muestra en hielo. A continuación, agregue 22 microlitros de DMSO de alta calidad a cada tubo de colorante SCI tres o S cinco; un tubo de colorante es suficiente para dos muestras. El colorante S SI tres se utiliza para marcar sus muestras de referencia y el colorante SCI cinco se utiliza para marcar sus muestras de ensayo.Vortexee los colorantes para mezclarlos completamente. Recuerde mantener los colorantes en la oscuridad hasta que estén listos para usar. No prepare los colorantes con más de una hora de anticipación y asegúrese de que en ningún momento entre agua en la mezcla de colorante con DMSO.Ahora añada 11 microlitros de la mezcla de colorante D-M-S-O-S preparada a cada muestra y mezcle bien mediante vortex. Incube suavemente durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Cubra las muestras con papel de aluminio o guárdelas en un cajón para minimizar la exposición a la luz.Después de la incubación, añada 4,5 microlitros de hidroxilamina a cada muestra para detener la reacción y mezcle bien mediante vortex. Incube suavemente durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Cubra las muestras con papel de aluminio o guárdelas en un cajón para minimizar la exposición a la luz.Para limpiar la etiqueta, se realiza vortex con las perlas de unión al ARN. Breve agitación para obtener una mezcla homogénea antes del uso; prepare la mezcla de unión al ARN A a temperatura ambiente. Mezcle bien la mezcla de unión mediante vortex y alícuota el tampón de elución de ARN A en un tubo de 1,5 mililitros e incube a 50-60 grados Celsius durante al menos 10 minutos.Añada 70 microlitros de la mezcla de unión de ARN A a cada muestra y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cuatro veces; después de mezclar, transfiera las muestras desde la placa de PCR a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. A continuación, añada 50 microlitros de isopropanol al cien por cien a cada muestra y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cuatro veces. Agite suavemente la placa en un agitador orbital durante al menos dos minutos.Para mezclar completamente las muestras. Coloque la placa en un soporte magnético para capturar las perlas magnéticas.Deje la placa en el soporte hasta que la mezcla se vuelva transparente y las perlas de unión se sedimenten. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador al vacío sin perturbar las perlas magnéticas. Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante.En este punto, el sobrenadante debe tener un color rosa brillante o azul brillante debido a las moléculas de colorante no incorporadas. Una vez que se haya descartado el sobrenadante, retire la placa del soporte magnético. A continuación, agregue cien microlitros de una solución de lavado de ARN a cada pocillo y agite la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad moderada.Las perlas pueden no dispersarse completamente en este paso; regrese la placa a un soporte magnético para capturar las perlas magnéticas. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador al vacío sin perturbar las perlas magnéticas.Alternativamente, retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y deseche el sobrenadante. Retire la placa del soporte magnético. Repita el lavado una segunda vez con 100 microlitros de solución de lavado de ARN A.Después del segundo lavado, seque las perlas agitando la placa durante un minuto en el agitador orbital a velocidad máxima. No seque en exceso las muestras; eluya el ARN A de las perlas añadiendo 20 microlitros de tampón de elución de ARN A precalentado.Agite vigorosamente cada muestra en la placa sobre el agitador orbital durante tres minutos. Luego, verifique que las perlas magnéticas estén completamente dispersas. Si no lo están, continúe agitando.Una vez que las perlas magnéticas estén completamente dispersas, mueva la placa a un soporte magnético para capturar las perlas magnéticas. El sobrenadante contiene las muestras de ARN A marcadas y purificadas, y debe tener un color rosa pálido o azul pálido. A continuación, transfiera cuidadosamente el ARN A mencionado a una nueva placa para PCR o a tubos para PCR.En este momento, puede verificar la concentración de ARN y la cantidad de colorante en las muestras midiendo 1.5 microlitros en un espectrofotómetro NanoDrop. Utilizando el módulo de microarreglo, hibride inmediatamente el ARN marcado A en una plataforma de microarreglo de su elección. O, alternativamente, puede almacenar el ARN marcado A a menos 80 grados Celsius hasta que esté listo para la hibridación.Esta es una lectura representativa de un espectrofotómetro y la gráfica de DO generada utilizando el espectrofotómetro NanoDrop para medir la concentración de la muestra y la incorporación del colorante. Puede observarse los picos de DO a 260 nanómetros para calcular la concentración de las muestras, así como los dos picos alrededor de 532 y 635 nanómetros que representan los colorantes S3 y SCI cinco, respectivamente. Acabamos de mostrarle cómo etiquetar fluorescentemente muestras de ARN con alelo inmunitario amplificado incorporado para hibridación en micromatriz.Al realizar este procedimiento, es importante recordar resuspender el colorante en DMSO menos de una hora antes de la acoplación y asegurarse de que no entre agua en la mezcla de colorante con DMSO, ya que reaccionaría con el grupo activo del colorante. También es importante recordar no secar en exceso el ARN, si es necesario. Las muestras se pueden secar hasta uno o dos microlitros en lugar de secarlas completamente, y luego resuspenderse bien en el tampón de acoplación durante la reacción de acoplación.Mantenga las reacciones en la oscuridad con agitaciones ocasionales y centrifugue si lo desea. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.Asegúrese de ver los otros videos de esta serie en los que mostramos cómo realizar una infección con curso temporal con el virus vaccinia, la extracción de ARN de las muestras y el procedimiento para la amplificación lineal de muestras de ARN.

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Biología

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