Cultivo primario de miocitos adultos de corazón de rata

En este trabajo se describe la forma típica de aislar y cultivar el corazón de rata adulta miocitos. Colagenasa y la proteasa se utilizan para digerir y aislar a los miocitos individuales. Miocitos cultivadas seguir este protocolo cumplir con los requisitos de la mayoría de los experimentos.

El procedimiento comienza con la extirpación del corazón de una rata adulta y la colocación en el sistema de perfusión. Las soluciones enzimáticas se dejan perfundir durante unos 30 minutos, después de lo cual se extrae el corazón. La digestión picada y enzimática permitió continuar en un vaso de precipitados pequeño.

Al final de la digestión, las células se disocian en una suspensión unicelular por agitación mecánica y se filtran en un tubo estéril. Las células cardíacas primarias se lavan tres veces en tampones con una concentración creciente de calcio, se resuspenden en cultivo, en medio y se colocan en placas de cultivo de tejido recubiertas de laminado. Hola, soy Shahi del laboratorio de Henry Cowa en el Departamento de Fisiología y Física Celular de la Universidad de Columbia.

Hoy te mostraremos un procedimiento para aislar y cultivar otras células cardíacas de rata. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los canales de calcio en el corazón. Así que comencemos.

El día antes de la cirugía con ratas, asegúrese de que todas las soluciones estén hechas, pero no agregue ninguna enzima todavía. Los tampones a, B y el tampón de lavado deben filtrarse para determinar su esterilidad antes de almacenarlos a cuatro grados centígrados. Seis placas de cultivo de tejidos de pocillos también deben cubrirse con solución laminada el día anterior y almacenarse a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2.

El día de la cirugía. Prepare los instrumentos quirúrgicos desinfectando las tijeras de pinza y las pinzas con etanol al 70% y déjelos secar sobre una toalla de papel. Se prepara una jeringa de un mililitro llena con medio mililitro de solución de heparina.

Ahora es una buena práctica lavar el aparato de perfusión que pasa por etanol al 70% con la bomba peristáltica en reversa. Una vez terminado, enjuague con etanol, enjuague el aparato con agua bidestilada y finalmente enjuague con tampón A. El flujo se recoge en un vaso de precipitados y se coloca en un baño de agua a 37 grados centígrados. Para preparar el aparato de profusión limpio, llene el tubo de la jeringa derecha con 40 mililitros de tampón A y el tubo de la jeringa izquierda con 40 mililitros de tampón B. Prepare el tubo de perfusión hasta la punta del catéter permitiendo que el tampón A fluya a través del aparato.

Rellene el tampón con una jeringa hasta el nivel de 40 mililitros. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas en el tubo después de este paso, ahora cierre el tampón, una jeringa con la válvula de llave de paso y repita el proceso de modo que el tubo de profusión ahora esté cebado con tampón B. El aparato de profusión finalmente está listo y se deja con el tampón. La válvula de llave de paso B se abre, pero el flujo se detiene.

Usando el regulador en la línea IV, deseche el flujo de tampón a través del vaso de precipitados colector. Lo último que debe hacer antes de la cirugía es agregar las enzimas requeridas a su solución madre y luego filtrar la solución enzimática tal como se filtraron las otras soluciones el día anterior. Una vez filtrada, esta solución se puede dejar a temperatura ambiente siguiendo el protocolo estándar.

Sacrificar a la rata con iso flúor en una cámara de gas. Desinfecte el área de la incisión en el tórax con etanol al 70%. Abre el cofre con unas tijeras y expone el corazón.

Inyecte en el ventrículo izquierdo 0,5 mililitros de solución de heparina. Extirpar el corazón con una gran parte de la aorta intacta. Inserte inmediatamente el catéter en la aorta.

Un corazón de rata típico debería producir una alta fracción de miocitos sanos en forma de bastón y pocas células muertas redondeadas. Si se sigue correctamente el siguiente procedimiento, para comenzar pinza la aorta al catéter. La punta del catéter no debe introducirse demasiado en el corazón para garantizar una buena perfusión del corazón a través de la arteria coronaria.

Una vez pinzada, se ata la aorta al catéter con la sutura. A continuación, abra el regulador de la línea intravenosa para permitir una tasa de goteo rápida y permitir que la abeja tampón lave el corazón durante el lavado de la abeja tampón. Use las tijeras pequeñas y las pinzas para extraer las aurículas y cualquier tejido graso o pulmonar adherido al corazón.

Una vez finalizado el búfer B, cambie el flujo a búfer por un tiempo. Se permite que el búfer A fluya durante cinco minutos. Caliente la solución enzimática en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Cuando el tampón A se agota de la jeringa pero aún está presente en el tubo, cargue 50 mililitros de la solución enzimática en la jeringa A del aparato de profusión. Ahora es necesario desechar todo el flujo que pasa por el vaso de precipitados de recolección en el baño de agua hasta que la solución enzimática examine el corazón. Tan pronto como la solución enzimática examine el corazón, active la bomba peristáltica, que está configurada para transferir la solución enzimática del vaso colector a la jeringa reabastecida.

A Permita que la solución enzimática fluya a través del corazón durante 10 minutos. A medida que el corazón digiere, comienza a verse hinchado a 37,5 microlitros de cloruro de calcio 0,1 molar a la solución enzimática en la jeringa A para dar una concentración efectiva de 0,1 milimolar de calcio. Esta es la primera de varias adiciones de cloruro de calcio utilizadas para aumentar la concentración después de 10 minutos, aumentar la concentración de calcio a 0,2 milimolar agregando 50 microlitros adicionales de cloruro de calcio 0,1 molar a la jeringa A y dejar que la profusión continúe durante 10 minutos más.

Una vez transcurridos 10 minutos, corte los ventrículos y transfiera el corazón a un pequeño vaso de precipitados estéril que contenga 20 mililitros de solución enzimática en el vaso de precipitados. Aumente la concentración de calcio a 0.4 milimolar agregando 40 microlitros más de cloruro de calcio 0.1 molar, pique suavemente el corazón en 10 o más pedazos con un par de tijeras estériles pequeñas. Ahora incube el vaso a 37 grados centígrados con un balanceo suave.

Después de cinco minutos de incubación, agregue 40 microlitros de cloruro de calcio 0.1 molar para obtener una concentración efectiva de 0.6 milimolar de calcio y repita suavemente las piezas del corazón con una pipeta de transferencia de plástico de tres a cinco veces después de incubar durante cinco minutos adicionales a 37 grados Celsius, agregue 40 microlitros de cloruro de calcio 0.1 molar e itere suavemente como antes. Utilice un filtro estéril de 500 micrómetros para separar los miocitos individuales digeridos del tejido conectivo no digerido. Deje que las células se asienten en un tubo de 50 mililitros durante 10 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante con una transferencia VI. Vuelva a suspender suavemente las células en el tampón de lavado número uno y deje que las células se asienten durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente mientras las células se asientan.

Tome una pequeña alícuota y aproveche este tiempo como una oportunidad para evaluar la calidad y la viabilidad de las células en suspensión bajo un microscopio invertido. Una buena preparación tendrá una alta proporción de células en forma de bastón con estrías nítidas. Una vez que las células se hayan asentado, deseche el snat y vuelva a suspender suavemente las células en el tampón de lavado.

Número dos, deje que las células se asienten a temperatura ambiente, lo que nuevamente debería tomar de 10 a 20 minutos y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender suavemente las células en un medio de suero al 5% antes de transferir las células a las placas de cultivo de tejidos. Lave las placas con una XSFM.

Transfiera las células a la densidad deseada e incube en una incubadora de cultivo de tejidos con CO2. Durante tres a cinco horas, cambie el medio a uno Las células XSFM se pueden cultivar durante un máximo de cuatro días y utilizar según sea necesario para los experimentos. Debe haber más del 70% de miocitos vivos al microscopio invertido cuando el protocolo se realiza correctamente.

Se trata de miocitos aislados transfectados con YFP REM después de ser cultivados durante 48 horas. Las células de esta calidad se cultivan normalmente a partir de este procedimiento. Solo le mostraremos cómo aislar y el cultivo son esas células calientes.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar ser lo más rápido y limpio posible. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.