Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente

La chica membrana corioalantoidea (CAM) es un entorno único, apoyo la cultura, naturalmente, inmunodeficientes para estudiar la angiogénesis y la tumorigénesis. Este artículo video demuestra las diferentes etapas de pollo Ex ovo Cultura, aplicación de sustancias potencialmente angiogénicos y la inoculación exitosa de las células tumorales y tejidos en la superficie de la CAM.

Hola, soy Susan Paa. Soy del Instituto de Química Fisiológica, departamento de Endocrinología Bioquímica de la Universidad de Burg Esen en Alemania. Hola, soy Daniel Ze Basian Dole.

Soy de la misma institución que Susan. Hola, soy Mann, del Departamento de Neurología del Instituto de Anatomía de la Universidad de Burg. Vamos a mostrarte cómo funciona realmente la cultura CH X y el ensayo de membrana co.

Así que vamos al laboratorio. En la mayoría de los estudios experimentales recientes, la cam que es la membrana de Chico, se expuso cortando una ventana a través de la cáscara del huevo, y se realizaron experimentos en ovo, resultando en limitaciones significativas en la accesibilidad de la CAM y en las posibilidades de observación y fotodocumentación de los efectos. Los cultivos X ovo de embriones de pollo facilitan significativamente la accesibilidad de la cámara y el embrión de pollo.

Véase el corazón palpitante, que permite una fácil documentación in vivo de los efectos y la manipulación experimental del embrión. En nuestro artículo de video, vamos a proporcionar una demostración paso a paso de la aplicación exitosa de la cultura X ovo para un gran número de preguntas científicas. Los huevos se incuban en una incubadora con una bandeja móvil.

Aquí puede ver el elemento calefactor y el transportador de bandejas rotando los huevos 12 veces al día de forma continua. La humedad se mantiene en el 60% agregando agua a los recipientes de plástico en la parte inferior de la incubadora, y la temperatura de incubación se establece en 37,5 grados centígrados antes de comenzar la incubación. La suciedad, las plumas y los excrementos se eliminan cuidadosamente de las cáscaras de los huevos, limpiando mecánicamente los huevos con etanol o desinfectante, sin embargo, reducen significativamente las tasas de supervivencia de los embriones.

Los huevos se colocan horizontalmente en la bandeja móvil de la incubadora. Asegúrese de mantener suficiente distancia entre los huevos individuales para permitir la rotación libre. Después de la incubación Durante 72 horas, los huevos se retiran de la incubadora y la parte superior de los huevos donde reside el embrión se marca con un lápiz.

Dado que el embrión resiste la rotación hasta cierto punto y permanece ubicado aquí Para una mejor sensación, no se deben usar guantes para romper los óvulos, pero las manos deben desinfectarse con etanol al 70%. El huevo se sostiene horizontalmente con una marca de lápiz en la parte superior y se agrieta en el borde de una barra de agitación magnética triangular Para obtener el máximo control de la fuerza durante los procedimientos de agrietamiento, los codos no deben descansar sobre la mesa. Es importante: Que la cáscara del huevo, así como la membrana del huevo, se abran durante el agrietamiento, la fuga de clara de huevo es una señal segura de que la membrana del huevo ha sido perforada.

El huevo se mantiene cerca del fondo del plato patriota. Para evitar una mayor fuga de clara de huevo durante este procedimiento de apertura inicial, es importante que la clara de huevo en el fondo del plato patriota aún esté conectada al resto dentro del huevo. Como esto da como resultado un vacío dentro del huevo que mantiene la yema en su lugar aplicando suavemente presión al meridiano que atraviesa la grieta y el ecuador del huevo con los dedos pulgar y medio, es posible regular el vacío y la extrusión del contenido del huevo.

A continuación, el contenido del huevo puede transferirse a la placa de Petri con la yema intacta. Si el huevo se levanta suavemente y ambas mitades de la cáscara se separan cuidadosamente, los cultivos ex ovo se colocan en una bandeja, se devuelven a una incubadora y se mantienen a 37,5 a 38,2 grados centígrados y 70% de humedad. No es necesario un suministro de dióxido de carbono u oxígeno.

Si se utilizan placas patriota especiales con espaciadores entre la tapa y la placa e incubadoras con una rejilla de ventilación, la rejilla de ventilación debe mantenerse abierta hasta la mitad. Los papeles de filtro de autoclave se utilizan como material de soporte para las sustancias líquidas aplicadas a la leva, ya que parecen causar la menor irritación de la leva. El lugar de aplicación debe estar a medio camino entre el embrión y el borde de la leva, ya que de lo contrario el embrión dificulta la observación microscópica de los efectos en la luz transmitida.

El líquido aquí atropina debe aplicarse inmediatamente después de que el filtro se haya colocado en la leva para evitar que se seque. Se deben volver a aplicar dosis adicionales o tampón todos los días. Cuando la leva está completamente desarrollada, se pueden aplicar hasta seis muestras diferentes y se pueden comparar los efectos en un Anillos de leva individuales cortados De un mililitro, la punta de la pipeta debe cortarse lo más delgada posible para minimizar el peso y evitar la hendidura de la leva.

A continuación, el anillo se aplica a la leva y las células se pipetean en el anillo. Una jeringa de microlitro Hamilton se enjuaga varias veces con etanol al 70% y finalmente con solución salina tamponada con fosfato estéril o PBS, la micro jeringa se llena con una suspensión celular preparada con cuidado pero rápidamente penetra en la leva y las capas oculares con la aguja de la jeringa e inyecta continuamente la suspensión celular. La aguja debe permanecer unos segundos en el ojo para evitar una pérdida de la célula inyectada en suspensión por control de fugas X Ovo.

Los cultivos de óvulos incubados durante tres días se utilizan como donantes de yemas de extremidades. El embrión se disecciona de los vasos vitelinos conectados. Al cortar un círculo, el embrión se transfiere a una placa de Petri llena de PBS estéril frío mediante el uso de una pequeña cuchara de drenaje y se lava mediante agitación.

A continuación, el embrión se transfiere a una placa de Petri fresca llena de PBS estéril y se libera de las membranas circundantes, separándolas cuidadosamente con unas pinzas finas. Las yemas de las extremidades se separan con pinzas lo más cerca posible del cuerpo, se agarran y se transfieren a la cámara de un pollo huésped de ocho a 10 días de edad. En el lugar de aplicación deseado, la leva se traumatiza selectivamente mediante un raspado suave con un trozo de las pinzas.

A continuación, se agarra el injerto y se coloca en capas sobre la leva con el otro trozo de las pinzas. El ratón hembra de sacrificio está fijado en un tablero. La pared abdominal se humedece con un corte de etanol al 70% a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente con alfileres.

El útero se extrae del abdomen, se separa y se transfiere a un vaso de precipitados. Con PBS frío. Las membranas embrionarias se extraen cuidadosamente mediante el uso de fórceps con fines de demostración.

Aquí se muestra un embrión de ratón de 16 días para una mejor visibilidad de las yemas de las extremidades. Solo se obtienen resultados óptimos de injerto. Sin embargo, si se utilizan yemas de las extremidades de embriones de 10 a 13 días de edad, se cortan las yemas de las extremidades o se utilizan pinzas finas lo más cerca posible del cuerpo.

En el lugar de aplicación deseado, la CAM se traumatiza selectivamente mediante un raspado suave con pinzas. Luego, se agarran las yemas de las extremidades y se transfieren a la CAM de un pollo huésped de ocho a 10 días de edad. El injerto se coloca una o dos veces en un lado de la leva donde no se pretende realizar un injerto final para eliminar el exceso de PBS.

Lo ideal es que los injertos se coloquen en la leva cerca de una bifurcación en Y de un tumor de un vaso sanguíneo. Las biopsias se cortan en trozos de uno o dos milímetros cúbicos con bisturíes estériles. Tomar material de la superficie de la biopsia aumenta el riesgo de contaminación con músculo o tejido conectivo.

En el lugar de aplicación deseado, la CAM se traumatiza selectivamente mediante un raspado suave. Una pieza del núcleo de la muestra de biopsia se injerta en la CAM de un pollo huésped de ocho a 10 días de edad. Los injertos se colocan idealmente en la leva cerca de una bifurcación en Y de un vaso sanguíneo.

A continuación, el injerto se transfiere a la CAM con un mínimo de PBS adjunto. Se puede aplicar una ligera presión para maniobrar el injerto en una hendidura resultante de la leva. El embrión de polluelo huésped muere por decapitación.

El CAM con el injerto adjunto se retira mediante un corte circular y se transfiere a una placa de Petri llena de PBS. Se corta el exceso de CAM del injerto, excepto en el sitio de fijación anterior. De nuevo en el sitio de aplicación deseado.

La leva de un nuevo embrión de pollito huésped se traumatiza selectivamente mediante un raspado suave y el injerto se transfiere a la leva del segundo huésped con un mínimo de PBS adjunto. Acabamos de demostrar cómo funciona realmente CH X o cultura. Les mostré las ventajas en comparación con los experimentos de Orval y les di algunos ejemplos para su aplicación.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.