Name: Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 17 min 23 s
Description: Aprenda el cultivo ex ovo de embriones de pollo y el ensayo en membrana corioalantoica para estudiar angiogénesis y tumorigénesis. Este método facilita la observación in vivo y la manipulación experimental.

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Los autores desean agradecer a J. Kueper y Wittschier J. por su excelente asistencia técnica y el profesor de Ruebben generosamente proporcionaron el material tumoral.

Todos los equipos y reactivos para comprar estéril o tiene que ser calor o vapor esterilizado o esterilizado con EtOH al 70%. Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Duisburg-Essen (Alemania). Parte 1: La incubación de los huevos <ol><li> Los huevos fertilizados pueden ser almacenados a 13 º C durante un máximo de una semana. </li><li> Los huevos son incubados durante 72 horas, en posición horizontal en una incubadora con una bandeja de movimiento, la rotación de los huevos 12 veces al día continuamente. La humedad se mantiene a 60 - 62%, temperatura de incubación a 37,5 ° C. Nota: Antes de comenzar la incubación, la suciedad, las plumas y los excrementos son cuidadosamente de las cáscaras de huevo mecánicamente por secarla con toallas comunes, en zig-zag gris papel para las manos, que tienen un duro en lugar de una estructura de superficie blanda. Limpieza de los huevos con etanol u otro desinfectante, sin embargo, redujo significativamente la tasa de supervivencia de los embriones, independientemente de que el líquido utilizado. </li></ol> Parte 2: Ex ovo cultura <ol><li> Después de la incubación durante 72 horas, los huevos son retirados de la incubadora. Nota: Los huevos son incubados durante 72 horas debido a que - de acuerdo a nuestras experiencias - por razones desconocidas, pero de acuerdo con Auerbach et al1 etapas de desarrollo anteriores eran mucho más bajas tasas de supervivencia. En etapas posteriores de 72 horas el saco vitelino, que aún no está cubierto por la CAM se vuelve más delgada y tiende a adherirse a la cáscara del huevo líder (i) a pequeñas hemorragias en la zona de adherencia y (ii) la ruptura de la yema del saco membrana. Por lo tanto, el método presentado no es aplicable a los embriones de más de 72 horas. </li><li> La parte superior de los huevos, cuando el embrión se encuentra, está marcada por el lápiz desde el embrión resiste la rotación hasta cierto punto. </li><li> El huevo está en posición horizontal con la marca del lápiz en la parte superior y agrietadas en el borde de un 80 mm triangular barra de agitación magnética por la que se orientados perpendicularmente al eje longitudinal del huevo. Nota: Para una mejor sensación, no se debe utilizar guantes, pero las manos se deben desinfectar con un 70% EtOH. Es importante que la cáscara del huevo, así como la membrana del huevo se abrió. Fugas de clara de huevo es un signo seguro de que la membrana del huevo se ha perforado. </li><li> El huevo se mantiene cerca de la parte inferior de la placa de Petri para evitar escapes de clara de huevo. Nota: Durante el proceso de apertura inicial, es importante que la clara de huevo en la parte inferior de la placa de Petri todavía está conectado con el resto en el interior del huevo ya que esto da lugar a un vacío en el interior del huevo que contiene la yema de huevo con el embrión en la parte superior dentro de el huevo. El vacío se puede regular, ya sea por la presión del dedo, que controla la entrada de aire en el huevo o el huevo, levantando lo que aumenta la columna de la conexión es decir, la clara de huevo vacío. </li><li> Ejerciendo una suave presión con el meridiano que atraviesa la grieta y el ecuador del huevo con el pulgar y el dedo medio, es posible regular el vacío. El contenido del huevo puede ser transferida a la placa de Petri en buen estado, si el huevo con la yema de huevo se levanta suavemente y las dos mitades de la cáscara se separan cuidadosamente. El embrión y la yema de los barcos que se encuentran en la parte superior de la yema de un buen estado. Nota: Si la marca del lápiz no se mantiene en la parte superior, el embrión puede ser herido cuando agrietamiento de la cáscara. Si los huevos no estén agrietados o con la suficiente atención a los embriones tienen más de 72 horas (ver arriba), el saco vitelino se adhiere a la concha y se rompe con frecuencia. Lo mismo ocurre cuando la humedad de la incubadora es inferior al 60% o los huevos no se giran durante la incubación. </li><li> Ex ovo culturas se devuelven a la incubadora y se mantiene a 37,5 ° 38,2 ° C y una humedad del 60%. CO 2 y O 2 la oferta no es necesario si la incubadora no está cerrada herméticamente (rejilla de ventilación parcialmente abierta!) Y platos de Petri con separadores entre la tapa y el plato se utilizan. Nota: Movimiento de los embriones deben mantenerse a un mínimo durante los primeros días de incubación. Demasiada agitación en altas tasas de mortalidad. De incubación de 9 días en adelante, los embriones son menos sensibles a la agitación. Embriones muertos deben ser retirados inmediatamente para evitar infecciones. Si incubadoras de cultivo de células se utilizan, que están herméticamente cerrados, la oferta de O 2 es obligatoria para los embriones que no se muera. La humedad es esencial para la CAM no se sequen y si la temperatura de incubación es inferior a 37 ° C, los embriones se desarrollan con demasiada lentitud. </li></ol> Parte 3: Aplicación de sustancias para los ensayos de la angiogénesis <ol><li> Autoclave papeles doblados filtro (50,5 mm de diámetro) se perforan por una perforadora y se utiliza como material de apoyo (soporte) para las sustancias líquidas aplicadas a la medicina complementaria y alternativa. Nota: Casi cada material de soporte (ver tabla abajo) causó la irritación de la CAM, especialmente cuando se aplica antes del día de incubación de 10, ya que cambió la arquitectura CAM barco en desarrollo. Esto también incluye sustancias potencialmente inerte como el papel de hidroxietilcelulosa, esponjas de teflón (PTFE-pledgets), esponjas de colágeno, lámina de colágeno, una gasa estéril (hisopos), se desliza alrededor de la cubierta, y los anillos de silicona, lo que causó todos los resultados positivos falsos. Papel de filtro parecía causar el menor irritación y se utilizó por lo tanto, en nuestros ensayos. </li><li> Cuando la CAM se ha desarrollado plenamente, hasta 6 muestras diferentes se pueden aplicar y sus efectos se pueden comparar en una sola CAM. </li><li> Para evitar que se sequen las dosis filtros adicionales (3 mg angiotropina nativo) o de amortiguación (5 l de PBS) se debe volver a aplicarse cada día. </li><li> Desde el día 3 después de la aplicación, los vasos sanguíneos orientarse hacia las sustancias angiogénicas en los filtros, mientras que el patrón de los vasos sanguíneos que rodean los controles no se ha modificado. Nota: La CAM no debe confundirse con la yema de huevo-saco. La CAM es una estructura dinámica de desarrollo, mientras que el saco vitelino es estática con variaciones poco durante el desarrollo. En el desarrollo de tres días de la CAM en desarrollo puede ser reconocido por primera vez en el extremo caudal del embrión como una pequeña vesícula. Entre los días tres y diez días de la vesícula inicial se expande, creando un plegado de dos capas de membrana overgrowing el saco vitelino a un ritmo creciente. El lugar de aplicación debe estar a medio camino entre el embrión y el pliegue de la CAM (frontera) de otra manera el embrión dificulta la observación microscópica de los efectos de la luz transmitida. Por otra parte, el filtro con la sustancia angiogénica se internaliza cuando el CAM sigue creciendo. </li></ol> Parte 4: La inoculación de las células en la CAM 4.1.Preparation de las células <ol><li> Las células confluentes se transfieren del frasco de cultivo a tubos Falcon por el uso de una pipeta de plástico estéril 25 ml con una pipeta de ayuda. </li><li> Para estimar el número de células, 15 l de la suspensión celular se transfirió a una cámara de Neubauer y las células se cuentan manualmente con un microscopio. </li><li> Tubos Falcon se centrifugan durante 3 minutos a 1000 rpm a temperatura ambiente y se descarta el sobrenadante. </li><li> Para el seguimiento de células vivas, las células se diluyen con PBS a la concentración deseada (en este caso: 2x10 7 células / ml) y se tiñeron con, por ejemplo PKH26 (Sigma), un fluorescente de color rojo vivo la membrana celular kit de etiquetado, según el protocolo del fabricante. Las células son resuspendidas en medio de cultivo celular (preferentemente Dulbecco modificada de águila; DMEM) a la concentración deseada para la inyección (10 7 células / ml) o la inoculación (3x10 6 células / ml). Diferentes concentraciones de células se aplican las inyecciones contra la inoculación de acuerdo a las concentraciones ya publicados en la literatura 15-17 y nuestra experiencia. </li></ol> 4.2 La inoculación de las células en la CAM <ol><li> Anillos (~ 1 mm de espesor) se cortan de una punta de la pipeta de 1 ml o un catéter venoso periférico (CVP) del tubo por el uso de un bisturí y se aplica a la CAM de un ovo chica E6-E14 embrión ex cultivadas. Nota: Trate de no "vio" varias veces, pero para cortar la punta de la pipeta o catéter con un corte con un bisturí nuevo, muy fuerte para evitar los bordes afilados de los anillos resultantes. Revise los anillos bajo el microscopio en busca de bordes afilados como resultado de micro-fisuras. </li><li> Dependiendo del tamaño de los anillos de 20 l de 3x10 6 células / ml con pipeta las células en total en un anillo o como volúmenes divididos en múltiples anillos. Nota: En algunos casos trauma de la CAM por raspado suave es un pre-requisito, por ejemplo, para facilitar la inoculación de células de 17 y pulmonar de los injertos (ver más abajo). Sin embargo, si la traumatización de la CAM no se pretende ni se contraindica, por ejemplo, para los estudios sobre el potencial invasor de las células tumorales, los anillos no deben ser utilizados para la inoculación, pero las células se debe aplicar directamente como la aplicación de anillos o anillos se pueden inducir lesión micro . Si los anillos se utilizan, estos se deben cortar lo más fina posible para minimizar el peso y evitar la sangría de la CAM. </li></ol> Parte 5: inyección intravítrea de células <ol><li> Una jeringa Hamilton microlitro se enjuaga varias veces con EtOH al 70% y finalmente con PBS estéril. </li><li> La jeringa micro se llena con la suspensión celular preparada manchados o sin teñir (ver apartado 4.1). Nota: El sitio de la inyección debe ser cuidadosamente seleccionado, de no lesionar los vasos sanguíneos de las estructuras adyacentes CAM o del embrión (brain!) por sobre la penetración de la aguja. La inyección se debe realizar bajo un binocular de disección. </li><li> Bajo el control de microscopio, Con cuidado, pero rápidamente penetran en la CAM y las capas del ojo con la aguja de la jeringa y continuamente se inyectan de 10 a 20 máximo de suspensión de células l (preferentemente diluido en PBS) en el humor vítreo de los ovo embrión de pollo ex cultivadas. Nota: Si la CAM no puede ser penetrado con la aguja, puede ser removido en un sitio con pocos vasos sanguíneos o no de él con cuidado separando con dos pinzas. </li><li> La aguja debe permanecer 02.01 segundos en el ojo para evitar la pérdida de la suspensión de células inyectadas por fugas. </li></ol> Parte 6: Disección de esbozos de los miembros de pollo <ol><li> Los huevos son retirados de la incubadora después de 3 a 4 días de incubación (E3/E4 = Hamburguesa Hamilton (HH) stage18-23) </li><li> Los huevos están rotos en el borde de una barra de agitación magnética triangular y se transfieren a una placa de Petri (detalles: véase la Parte 2) y el embrión se diseca la yema de los vasos conectados mediante la reducción de un círculo con unas tijeras de primavera. </li><li> El embrión se transfiere a una nueva placa de Petri llena de frío, PBS estéril por el uso de una cuchara pequeña de drenaje y lavado por agitación tipo. </li><li> El embrión se transfiere a una pequeña placa de Petri llena con PBS estéril y libre de las membranas que rodean, cuidadosamente desgarrando con unas pinzas finas. </li><li> Esbozos de los miembros se separan por pinzas de microcirugía lo más cerca del cuerpo como sea posible, captar y transferir a la CAM de un ovo host de 8 a 10 días de edad, ex pollo cultivadas (ver procedimiento de injerto). </li></ol> Parte 7: Preparación de esbozos de los miembros del ratón <ol><li> Apareamientos vez embarazadas se establecen y la mañana del día en que se detecta un tapón vaginal en el apareamiento las hembras se designa 0 días de gestación. </li><li> La mujer embarazada se sacrificaron por dislocación cervical cuando el desarrollo de los embriones llegó el día embrionario (E) 10 a 13 y fija en una tabla de cera. </li><li> La pared abdominal se humedece con EtOH al 70%, corte a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente por alfileres. </li><li> Los dos cuernos del útero se extirpan del abdomen, individual y se transfiere a un recipiente con PBS frío. </li><li> Los embriones se separan, se transfirió a una placa de Petri y la pared del útero y las membranas embrionarias son retiradas por el uso de fórceps. </li><li> Esbozos de los miembros son cortados por el uso de tijeras de primavera o separado por unas pinzas finas tan cerca del cuerpo como sea posible, captar y transferir a la CAM de 8 a 10 días de edad in ovo de pollo cultivados ex anfitrión (ver procedimiento de injerto). </li></ol> Parte 8: Colección de muestras de tumores <ol><li> Biopsias de los tumores se recogen en 2 ml tubos Eppendorf llena con un medio de cultivo de células del tumor-específica (en este medio de Leibovitz) y se mantiene a temperatura ambiente. </li><li> Biopsias de los tumores se cortan en pedazos por 1-2 mm3 bisturí estéril. Nota: Si las muestras de tumor eran demasiado pequeños, es posible que no se adhieren a la CAM, si eran demasiado grandes, la CAM podría estar lesionado y el embrión podría morir. </li><li> Una pieza de la base de la muestra de biopsia se injerta en la CAM de 8 a 10 días de edad ovo pollo anfitrión cultivadas ex (ver procedimiento de injerto). Nota: Toma de material de la superficie de la biopsia aumenta el riesgo de contaminación con el músculo o tejido conectivo. </li></ol> Parte 9: procedimiento de injerto <ol><li> Para el injerto de yemas de las extremidades o las muestras de tumor, el completamente desarrollado CAM de 8 a 10 días de edad embriones de pollo cultivados ex ovo se utiliza. </li><li> Los injertos son muy bien situado en la medicina complementaria y alternativa cerca de una bifurcación Y de un vaso sanguíneo. </li><li> En el sitio de aplicación deseada, la CAM es selectiva traumatizados por fuera raspado suave (pinzas) de la parte superior peridermal de la capa epitelial de matrimonio, dejando la capa basal intacta. Nota: es esencial para evitar el sangrado o ruptura de los capilares visibles. </li><li> El injerto es transferida a la CAM con un mínimo de PBS adjunto. Dependiendo de la prótesis, puede ser colocado una o dos veces en un sitio de la CAM, donde no definitiva injerto se destina a eliminar exceso de PBS y, finalmente, injertados en el sitio de CAM preparado traumatizados. </li><li> El injerto se sujeta por pinzas finas y capas en la CAM. Dependiendo de la sensibilidad del injerto, la presión de la luz podría ser aplicado (no apto para esbozos de los miembros) para maniobrar el injerto en una hendidura que resulta de la CAM (apropiado para muestras de tumor). Nota: Como el sistema inmunológico de pollo se desarrolla en el día embrionario (E) 18, ex ovo culturas xenoinjertos no debe prolongarse más allá del E17 como los embriones de pollo de acogida con frecuencia mueren. Es importante tener CAM dispone de sede, respectivamente ovo embriones de pollo cultivados ex, para coincidir con una fuente de tejido de un donante de su elección. </li></ol> Parte 10: Re-injerto <ol><li> El embrión de pollo de acogida es muerto por decapitación. </li><li> La CAM conel injerto unido se elimina mediante un corte circular con tijeras con punta y se transfieren a una placa de Petri llena de PBS. </li><li> CAM excesiva se corta con tijeras el injerto de primavera a excepción del sitio de unión anterior. </li><li> En el caso de las muestras de tumor más grande, el injerto se corta en mitades o en varios pedazos más pequeños y re-injertados con el filo hacia el CAM de nuevo el segundo host. </li></ol> Parte 11: Resultados de Representante <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Caparazón de pollo cultura Embriones de pollo de las diferentes etapas de desarrollo cultivadas ex ovo en placas de Petri. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ex ensayo de angiogénesis in ovo CAM Fecundados los huevos de gallina se incubaron horizontalmente a 37 ° C y una humedad de 60 - 62% y agrietada en placas de Petri en el día embrionario 4 (E4). Se continuó la incubación en las mismas condiciones. E10, papeles filtro estéril (5,5 mm de diámetro) en capas en la parte superior de la CAM y empapado, ya sea con 5 l de PBS o 3 mg nativos angiotropin6. Capilares mostró la alineación obvia hacia el angiotropina filtro de papel empapado en E14. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Ex ovo el injerto de yemas de las extremidades Esbozos de los miembros de la chica (E3/E4) y el ratón (E13) se injerta en la CAM de las culturas de pollo sin caparazón. Los vasos sanguíneos de la CAM entró en la yemas de las extremidades después de dos días. El desarrollo de los esbozos de los miembros continuaron en estas culturas ex ovo llegando a una etapa en la falange dos de pollo y la visualización de la reducción de las webs interdigital en esbozos de los miembros murino. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Inoculación ex ovo de la muestra de tumor Una muestra de la biopsia de carcinoma de vejiga se inoculó en la CAM de un ovo de pollo de 10 días de edad, ex embriones cultivados. Después de dos días en la cultura, el espécimen estaba conectado a la vasculatura CAM y después de 7 días, múltiples vasos sanguíneos que entran el injerto se observaron.

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Innovadora o simplemente un protocolo de pollo cultura? Con el ex protocolos de cultivo de concha menos 1.4 la tasa de supervivencia total de los embriones de pollo fueron bajos, por ejemplo, ca. 30% 1. El protocolo ex refinada cultura ovo descrito en este artículo de vídeo, por el contrario, permite que las tasas de supervivencia superiores al 50%. En comparación con los clásicos en las culturas ovo cultura ex ovo de embrion...

<table><tbody><tr><td>Huevos fertilizados</td><td>Animal</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Animal</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora Tipo 3000 con bandeja giratoria para huevos</td><td>Herramientas</td><td>Siemens AG</td><td>9503</td><td>Mantener a 37&amp;#x00B0;C con humedad relativa ajustada por encima del 60 %</td></tr><tr><td>Incubadora de huevos BSS 160</td><td>Herramientas</td><td>Grumbach, Alemania</td><td>8101</td><td>Mantener a 37-38 °C con humedad relativa superior al 60 %</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>El PBS debe estar frío (&lt;fuerte&gt;&amp;gt;&lt;/strong&gt; 4&amp;#x00B0;C) y estéril</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modificado de Eagle&amp;rsquo;medio s</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 6429</td><td>medio de cultivo DMEM</td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;medio L-15 s L-1</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>31415-029</td><td>aquí: medio de recolección para muestras tumorales</td></tr><tr><td>Medio específico para células tumorales</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>cada grupo de investigación debe utilizar el medio en el que cultivan sus células tumorales o medios de cultivo comunes, por ejemplo, Leibovitz&amp;rsquo;s Medio o Dulbecco&amp;rsquo;s modificado de Eagle&amp;rsquo;medio s&lt;br/&gt;suplementado con 15% de suero bovino fetal (FBS), 4 mM de L-glutamina y 50 &amp;#x03BC;M insulina</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra de agitación magnética, triangular de 80 mm</td><td>Herramienta</td><td>VWR international</td><td>442-0391</td><td>Una barra magnética de agitación triangular sirve bien para romper la cáscara del huevo.</td></tr><tr><td>Pinzas DUMONT n.º 5 </td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>vástago muy fino biselado (punta de 0,05 mm x 0,02 mm)</td></tr><tr><td>Pinzas DUMONT n.º 7</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>vástagos curvados (punta de 0,07 mm x 0,10 mm)</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte, rectas, 8 cm</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td>cuchillas rectas finas y pequeñas</td></tr><tr><td>Tijeras de iris finas, rectas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Usar para cortar la membrana corioalantoidea</td></tr><tr><td>Tijeras estándar, rectas, puntas finas/romas</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td>Uso para decapitación o dislocación cervical</td></tr><tr><td>jeringa de microlitros 1702 TLLX, 25 &amp;mu;l</td><td>Herramienta</td><td>Hamilton Co</td><td>80222</td><td>Uso para inyección en el vítreo</td></tr><tr><td>Aguja Hamilton 33-G (15 mm)</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>18073-15</td><td>Uso para inyección en el vítreo</td></tr><tr><td>Escalpelos estériles</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td>Uso para la disección de muestras tumorales</td></tr><tr><td>Cucharilla de drenaje pequeña</td><td>Herramienta</td><td>Geuder</td><td>15758</td><td>Utilizar para la transferencia de embriones pequeños de pollo</td></tr><tr><td>Tablero de cera con alfileres de sujeción</td><td>Herramienta</td><td>Hecho en casa</td><td></td><td>Utilizar para la fijación de animales para disección</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 60 x 15 mm</td><td>Herramienta</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 92 x 16 mm</td><td>Herramienta</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1472</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril de 100 x 20 mm</td><td>Herramienta</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>extra profunda, con separadores para ventilación</td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td>300-600 ml</td></tr><tr><td>tubos FALCON</td><td>Herramienta</td><td>Falcon BD</td><td></td><td>15 ml y 50 ml</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Herramienta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>1,5 ml y 2 ml</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1 ml</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td>Utilice para cortar anillos de plástico destinados a la aplicación de sustancias o células</td></tr><tr><td>Catéter venoso periférico (CVP)</td><td>Herramienta</td><td>Viggo&amp;#174;</td><td></td><td>Utilizar para cortar anillos de silicona del tubo para la aplicación de sustancias / células</td></tr><tr><td>Pipetas y puntas</td><td>Herramienta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros plegados autoclavados 595 1/2, diámetro de 110 mm</td><td>Herramienta</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>311643</td><td>Portador, que causó la menor irritación de la membrana corioalantoidea; utilizado en el artículo</td></tr><tr><td>Pledget de PTFE, no reabsorbible, 6,3 x 152,4 x 1,6 mm</td><td>Herramienta</td><td>santec-medical</td><td>REF 277, LOTE 832/511-1</td><td>Portador; provocó resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Hidroxietilcelulosa Tylose H 100000</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td>Portador mezclado con Kollidon 17 PF; provocó resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Kollidon 17 PF</td><td>Reactivo</td><td>BASF</td><td>S30200</td><td>mezclado con hidroxietilcelulosa; provocó resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Matriz biológica de colágeno TissuDura</td><td>Herramienta</td><td>Baxter International Inc.</td><td>REF B2246000999999</td><td>Portador; provocó resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Cubrebocillos redondos de vidrio, 11 mm</td><td>Herramienta</td><td>Asistente Alemania</td><td>1001/0011</td><td>Portador; provoca resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Esponja de colágeno bovino</td><td>Herramienta</td><td>Wyeth Animal Health</td><td></td><td>Portador; provocó resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Membrana de colágeno reabsorbible Resodont</td><td>Herramienta</td><td>Resorba Woundcare Alemania</td><td>LOTE 280303</td><td>Portador; provocó resultados falsos positivos</td></tr><tr><td>Hisopos no tejidos</td><td>Herramienta</td><td>Fink Walter GmbH</td><td>REF 328132</td><td>Portador; provocó resultados falsos positivos</td></tr></tbody></table>

pollo ex ovo cultura y ex ovo cam ensayo: cómo funciona realmente

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Los huevos de gallina en la primera fase de cría se encuentran entre in vitro e in vivo en los sistemas y proporcionar un entorno de pruebas vasculares no sólo para estudiar la angiogénesis, sino también para estudiar la génesis tumoral. Después de la membrana corioalantoidea de pollo (CAM) ha desarrollado, la red de vasos sanguíneos se puede acceder fácilmente, manipulado y observado y por lo tanto proporciona un ajuste óptimo para los ensayos de la angiogénesis. Dado que el sistema linfático no se desarrolla completamente hasta las últimas etapas de incubación, el embrión de pollo sirve como anfitrión natural inmunodeficientes capaz de sostener los tejidos injertados y las células sin las restricciones propias de cada especie. Además de fomentar el desarrollo de asignación y xenoinjertos, la sangre CAM red de vasos proporciona un entorno único de apoyo para intravasation de las células tumorales, la difusión, y la detención vascular y un depósito donde las células detenidas extravasado para formar micro focos metastásicos. Con fines experimentales, en la mayoría de los estudios recientes de la CAM fue expuesto por el corte de una ventana a través de la cáscara del huevo y los experimentos se llevaron a cabo in ovo, dando lugar a importantes limitaciones en la accesibilidad de la CAM y las posibilidades de observación y documentación fotográfica de los efectos. Cuando caparazón culturas del embrión de pollo se utilizaron 4.1, no se proporcionaron detalles del experimento y, si se ha publicado en todos, las tasas de supervivencia de estas culturas eran bajos. Hemos perfeccionado el método de cultivo ex ovo de embriones de pollo de manera significativa mediante la introducción de una extrusión racionalmente controlado el contenido del huevo. Estas culturas ex ovo mejorar la accesibilidad de la CAM de embriones de pollo y, lo que permite fácil en la documentación vivo de los efectos y facilitar la manipulación experimental del embrión. Esto permite la aplicación con éxito a un gran número de preguntas de carácter científico: (1) Como un ensayo de angiogénesis mejora de 5,6, (2) un montaje experimental para facilitar las inyecciones en el humor vítreo del ojo del embrión de pollo 7-9, (3) como un entorno de prueba para la difusión y intravasation de la dispersión de las células tumorales de líneas celulares establecidas inoculados en la CAM 10-12, (4) como un sistema mejorado para mantener el éxito del trasplante y la cultura de los esbozos de los miembros de pollo y ratones, así como 13 (5 ) para el injerto, propagación y re-injerto de tejido de tumores sólidos primarios obtenidos de las biopsias en la superficie de la CAM 14. En este artículo se describe el vídeo establecimiento de una cultura refinada chica ex ovo y el ensayo de CAM con tasas de supervivencia superiores al 50%. Además le ofrecemos una demostración paso a paso de la aplicación exitosa de la cultura ovo ex de un gran número de aplicaciones científicas. Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, y Gustmann Sebastián contribuyeron igualmente a este estudio.

La chica membrana corioalantoidea (CAM) es un entorno único, apoyo la cultura, naturalmente, inmunodeficientes para estudiar la angiogénesis y la tumorigénesis. Este artículo video demuestra las diferentes etapas de pollo<em&gt; Ex ovo</em&gt; Cultura, aplicación de sustancias potencialmente angiogénicos y la inoculación exitosa de las células tumorales y tejidos en la superficie de la CAM.

Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente

Los huevos de gallina en la fase temprana de incubación se encuentran entre los sistemas in vitro e in vivo y proporcionan un entorno de prueba vascular no solo para estudiar...

Hola, soy Susan Paa. Soy del Instituto de Química Fisiológica, departamento de Endocrinología Bioquímica de la Universidad de Burg Esen en Alemania. Hola, soy Daniel Ze Basian Dole.Soy de la misma institución que Susan. Hola, soy Mann del Instituto de Anatomía, Departamento de Neuro, de la Universidad de Burg. Vamos a mostrarle cómo funcionan realmente el cultivo de CH X y el ensayo de membrana co.Así que vamos al laboratorio. En la mayoría de los estudios experimentales recientes, el CAM, es decir, la membrana corioalantoidea, se expuso mediante un corte de ventana a través del cascarón del huevo, y los experimentos se realizaron in ovo, lo que provocó limitaciones significativas en el acceso al CAM y en las posibilidades de observación y documentación fotográfica de los efectos. Los cultivos ex ovo de embriones de pollo facilitan notablemente el acceso al CAM y al embrión de pollo.Consulte el corazón latiendo, lo que permite una documentación fácil in vivo de los efectos y la manipulación experimental del embrión. En nuestro artículo en video, proporcionaremos una demostración paso a paso de la aplicación exitosa del cultivo X ovo para un gran número de preguntas científicas. Los huevos se incuban en una incubadora con una bandeja móvil.Aquí puede observarse el elemento calefactor y el mecanismo giratorio que mueve las bandejas, rotando los huevos 12 veces al día de forma continua. La humedad se mantiene al 60 % añadiendo agua a recipientes de plástico en la parte inferior de la incubadora, y la temperatura de incubación se ajusta a 37,5 grados centígrados antes de iniciar la incubación. Se eliminan cuidadosamente la suciedad, las plumas y los excrementos de las cáscaras de los huevos; sin embargo, limpiar mecánicamente los huevos con etanol o desinfectante reduce significativamente las tasas de supervivencia de los embriones.Los huevos se colocan horizontalmente sobre la bandeja móvil de la incubadora. Asegúrese de mantener una distancia suficiente entre los huevos individuales para permitir una rotación libre. Después de la incubación durante 72 horas, se retiran los huevos de la incubadora y se marca con lápiz el lado superior de los huevos donde se encuentra el embrión.Dado que el embrión ofrece cierta resistencia a la rotación y permanece ubicado aquí, para una mejor sensación, no se deben usar guantes para romper los huevos, pero las manos deben desinfectarse con etanol al 70 %. El huevo se sostiene horizontalmente con una marca de lápiz en la parte superior y se rompe sobre el borde de una barra imantada de agitación triangular. Para un control máximo de la fuerza durante el procedimiento de rotura, los codos no deben apoyarse sobre la superficie del banco. Es importante que tanto la cáscara del huevo como la membrana del huevo queden abiertas al romperlo; el escape de clara de huevo es una señal segura de que la membrana del huevo ha sido perforada.El huevo se mantiene cerca del fondo del platillo patriota. Para evitar una mayor pérdida de clara durante este procedimiento inicial de apertura, es importante que la clara en la parte inferior del platillo patriota siga conectada al resto del interior del huevo. Dado que esto genera un vacío dentro del huevo que mantiene la yema en su lugar, al aplicar suavemente presión sobre el meridiano que atraviesa la grieta y el ecuador del huevo con el pulgar y el dedo medio, es posible regular el vacío y la extrusión del contenido del huevo.El contenido del huevo puede entonces transferirse a la placa de Petri con la yema intacta. Si se levanta suavemente el huevo y se separan cuidadosamente ambas mitades del cascarón, los cultivos ex ovo se colocan sobre una bandeja, se devuelven a una incubadora y se mantienen a 37,5-38,2 grados centígrados y 70 % de humedad. No es necesario un suministro de dióxido de carbono ni de oxígeno.Si se utilizan placas patriota especiales con espaciadores entre la tapa y la placa y incubadoras con una rejilla de ventilación, la rejilla de ventilación debe mantenerse medio abierta. Se usan papeles filtro autoclavados como material de soporte para sustancias líquidas aplicadas al cam, ya que parecen causar la menor irritación del cam. El sitio de aplicación debe estar a mitad de camino entre el embrión y el borde del cam, ya que de lo contrario el embrión dificultaría la observación microscópica de los efectos en luz transmitida.El líquido atropina debe aplicarse inmediatamente después de colocar el filtro sobre el CAM para evitar que se seque. Cada día debe reaplicarse bien dosis adicionales bien tampón. Cuando el CAM esté completamente desarrollado, pueden aplicarse hasta seis muestras diferentes y sus efectos pueden compararse en un solo CAM. Los anillos cortados de una punta de pipeta de un mililitro deben cortarse lo más finos posible para minimizar el peso y evitar la indentación del CAM.A continuación, se aplica el anillo al cam y se pipetean las células dentro del anillo. Una jeringa microlitro Hamilton se enjuaga varias veces con etanol al 70 % y finalmente con solución salina tamponada con fosfato estéril o PBS. La microjeringa se llena con una suspensión celular preparada, y se penetra cuidadosa pero rápidamente el cam y las capas del ojo con la aguja de la jeringa, inyectando continuamente la suspensión celular. La aguja debe permanecer varios segundos dentro del ojo para evitar la pérdida de la suspensión celular inyectada por fugas. Compruebe X Ovo.Se utilizan cultivos de huevos incubados durante tres días como donantes de yemas de extremidades. Se disecciona el embrión de los vasos de yema conectados. Al cortar un círculo, se transfiere el embrión a una placa de Petri llena de PBS frío estéril mediante una cucharilla de drenaje pequeña y se lava mediante agitación.A continuación, el embrión se transfiere a una nueva placa de Petri llena con PBS estéril y se libera de las membranas circundantes, desgarrándolas cuidadosamente con una pinza fina. Los brotes de las extremidades se separan con la pinza lo más cerca posible del cuerpo, se toman y se transfieren al cam de un pollo huésped de ocho a 10 días de edad. En el sitio de aplicación deseado, el cam se traumatiza selectivamente mediante un suave raspado con una punta de la pinza.Luego, el injerto se sujeta y se coloca en capas sobre el vástago con la otra punta de la pinza. La hembra donante del ratón se fija sobre una tabla. La pared abdominal se humedece con etanol al 70 %, se corta a lo largo de la línea media y los colgajos de piel se fijan lateralmente mediante alfileres.El útero se extrae del abdomen, se separa y se transfiere a un vaso de precipitados con PBS frío. Las membranas embrionarias se eliminan cuidadosamente con pinzas con fines demostrativos.Se muestra aquí un embrión de ratón de 16 días para una mejor visibilidad de las yemas de las extremidades. Solo se obtienen resultados óptimos de injerto, sin embargo, si se utilizan yemas de extremidades de embriones de 10 a 13 días de edad, estas se cortan o se usa pinzas finas lo más cerca posible del cuerpo que sea posible.En el sitio deseado para la aplicación, la membrana corioalantoidea (CAM) se traumatiza selectivamente mediante raspado suave con pinzas. Luego, se toman los brotes de las extremidades y se transfieren a la CAM de un pollo huésped de ocho a diez días de edad. Una o dos veces, el injerto se coloca en un lado de la CAM donde no se pretende realizar el injerto final, con el fin de eliminar el exceso de PBS.Los injertos se colocan idealmente en la cámara cerca de una bifurcación en forma de Y de un tumor vascular. Las biopsias se cortan en trozos de uno a dos milímetros cúbicos mediante escalpelos estériles. Tomar material de la superficie de la biopsia aumenta el riesgo de contaminación con músculo o tejido conectivo.En el sitio de aplicación deseado, la membrana corioalantoidea (CAM) se traumatiza selectivamente mediante raspado suave. Un fragmento del núcleo de la muestra de biopsia se injerta en la CAM de un pollo huésped de entre ocho y diez días de edad. Los injertos se colocan idealmente sobre la CAM cerca de una bifurcación en Y de un vaso sanguíneo.El injerto se transfiere entonces a la membrana corioalantoidea con el mínimo volumen de PBS adherido. Se puede aplicar una ligera presión para colocar el injerto en la depresión resultante de la CAM. El embrión de pollo huésped se sacrifica mediante decapitación.La membrana corioalantoidea con el injerto adherido se retira mediante un corte circular y se transfiere a una placa de Petri llena con PBS. Se elimina el exceso de membrana corioalantoidea del injerto, excepto en el sitio de fijación anterior. Nuevamente en el sitio de aplicación deseado.La CAM de un nuevo embrión de ave huésped se traumatiza selectivamente mediante raspado suave y el injerto se transfiere a la CAM del segundo huésped con un mínimo de PBS adherido. Acabamos de demostrar cómo funciona realmente la cultura de CH X. Les mostré las ventajas en comparación con experimentos in ovo y les di algunos ejemplos de su aplicación.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra la nueva cultura, un método por el cual los embriones de pollo se cultivan fuera del huevo hasta por 24 horas. Este método le permite a uno para estudiar el desarrollo temprano (línea primitiva a 14 som.), Un período que corresponde a E7-9 en el ratón. Las aplicaciones de esta técnica incluyen la electroporación, la hibridación in situ e inmunohistoquímica.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

En este artículo se presenta una metodología sencilla para que a largo...

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

La<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-ensayo como un Xenograftmodel para el sarcoma

Cultivos de células de la retina de embriones de pollo constituyen herramientas valiosas para el estudio de la biología de los fotorreceptores. Hemos desarrollado una técnica de transferencia de genes eficiente, basado en ex ovo plásmido electroporación de las retinas antes del cultivo. Esta técnica aumenta considerablemente la eficiencia de transfección a través de protocolos disponibles en la actualidad, lo que hace posible la manipulación genética para este sistema.

Transferencia génica eficaz en polluelo retinas para estudios de cultivo celular primario: Un Ex-ovo Enfoque electroporación

Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).

Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

La membrana corioalantoidea (CAM) del pollo es inmunodeficiente y altamente vascularizada, lo que la convierte en un modelo natural in vivo de crecimiento tumoral y angiogénesis. En este protocolo, describimos un método confiable para el crecimiento de tumores tridimensionales de carcinoma hepatocelular vascularizado (CHC) utilizando el ensayo CAM.

los<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo como un modelo de xenoinjerto eficiente de carcinoma hepatocelular

A continuación, presentamos un protocolo para estudiar la invasión de las células tumorales en fragmentos de tejido normal que vive en tres dimensiones. Esta técnica de cultivo de órganos se aplica principalmente para probar fármacos potencialmente anti-invasivos in vitro.

Ensayo Invasión polluelo corazón para probar la invasividad de las células del cáncer y de la actividad de los compuestos potencialmente anti-invasivos

Aquí, presentamos una nueva técnica para cultivar embriones de pollo ex ovo para imágenes de lapso de tiempo utilizando luz transmitida y microscopía de fluorescencia. El sándwich de papel de filtro sumergido es una variante de la técnica de portador de papel de filtrobien establecida 1 que permite el cultivo de embriones de pollo completamente sumergidos en un medio de cultivo líquido.

Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo Ex Ovo Time-lapse de pollo temprano embriones

La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.

Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia

Aquí, describimos un protocolo para desarrollar un modelo de xenoinjerto de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo para tejido ovárico humano y demostramos la efectividad de la técnica, el marco de tiempo de revascularización del injerto y la viabilidad del tejido durante un período de injerto de 6 días.

El modelo de membrana corioalantoidea de pollo (CAM) como herramienta para estudiar el trasplante de tejido ovárico

Aprenda el cultivo ex ovo de embriones de pollo y el ensayo en membrana corioalantoica para estudiar angiogénesis y tumorigénesis. Este método facilita la observación in vivo y la manipulación experimental.

Pollo Ex ovo Cultura y Ex ovo CAM Ensayo: cómo funciona realmente

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