Name: Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprende a realizar imágenes in vivo de infecciones por Leishmania en ratones utilizando parásitos transgénicos bioluminiscentes. Este método no invasivo permite cuantificar la carga parasitaria longitudinalmente.

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Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de revisión al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos, por las subvenciones del NIH AI045540, AI067874, AI076233-01 y AI080801 (MEW), y por AI29646 (SMB). El trabajo fue realizado en parte en la financiación de la TC y la JG por el NIH T32 AI07511.

<ol><li>Capul, A. A., Barron, T., Dobson, D. E., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functionally+divergent+UDP-Gal+nucleotide+sugar+transporters+participate+in+phosphoglycan+synthesis+in+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two functionally divergent UDP-Gal nucleotide sugar transporters participate in phosphoglycan synthesis in Leishmania major.</a> J Biol Chem. 282, 14006-14017 (2007).</li>
<li>LeBowitz, J. H., Coburn, C. M., McMahon-Pratt, D., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+stable+Leishmania+expression+vector+and+application+to+the+study+of+parasite+surface+antigen+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of a stable Leishmania expression vector and application to the study of parasite surface antigen genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9736-9740 (1990).</li>
<li>Mureev, S., Kushnir, S., Kolesnikov, A. A., Breitling, R., Alexandrov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+Leishmania+tarentolae+transgenic+strains+free+of+selection+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of Leishmania tarentolae transgenic strains free of selection markers.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 71-83 (2007).</li>
<li>Chakkalath, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+a+beta-galactosidase+%28beta-GAL%29-specific+type+1+response+in+BALB%2Fc+mice+infected+with+beta-GAL-transfected+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Priming of a beta-galactosidase (beta-GAL)-specific type 1 response in BALB/c mice infected with beta-GAL-transfected Leishmania major.</a> Infect Immun. 68, 809-814 (2000).</li>
<li>Sacks, D. L., Perkins, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+infective+stage+of+Leishmania+promastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes.</a> Science. 223, 1417-1419 (1984).</li>
<li>da Silva, R., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metacyclogenesis+is+a+major+determinant+of+Leishmania+promastigote+virulence+and+attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Metacyclogenesis is a major determinant of Leishmania promastigote virulence and attenuation.</a> Infect Immun. 55, 2802-2806 (1987).</li>
<li>Spath, G. F., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipophosphoglycan-independent+method+for+isolation+of+infective+Leishmania+metacyclic+promastigotes+by+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation.</a> Exp Parasitol. 99, 97-103 (2001).</li>
<li>Scott, P., Caspar, P., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+Leishmania+major+in+BALB%2Fc+mice+by+adoptive+transfer+of+a+T+cell+clone+recognizing+a+low+molecular+weight+antigen+released+by+promastigotes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protection against Leishmania major in BALB/c mice by adoptive transfer of a T cell clone recognizing a low molecular weight antigen released by promastigotes.</a> J Immunol. 144, 1075-1079 (1990).</li>
<li>Belkaid, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+interleukin+%28IL%29-10+in+the+persistence+of+Leishmania+major+in+the+skin+after+healing+and+the+therapeutic+potential+of+anti-IL-10+receptor+antibody+for+sterile+cure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The role of interleukin (IL)-10 in the persistence of Leishmania major in the skin after healing and the therapeutic potential of anti-IL-10 receptor antibody for sterile cure.</a> J Exp Med. 194, 1497-1506 (2001).</li>
<li>Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+suppression+of+IFN-gamma+in+hepatic+granulomas+correlates+with+tissue-specific+replication+of+Leishmania+chagasi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local suppression of IFN-gamma in hepatic granulomas correlates with tissue-specific replication of Leishmania chagasi.</a> J Immunol. 156, 2231-2239 (1996).</li>
<li>McElrath, M. J., Murray, H. W., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+granuloma+formation+in+experimental+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The dynamics of granuloma formation in experimental visceral leishmaniasis.</a> J Exp Med. 167, 1927-1937 (1988).</li>
<li>Ato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+dendritic+cell+migration+and+impaired+resistance+to+Leishmania+donovani+infection+in+mice+deficient+in+CCL19+and+CCL21%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of dendritic cell migration and impaired resistance to Leishmania donovani infection in mice deficient in CCL19 and CCL21.</a> J Immunol. 176, 5486-5493 (2006).</li>
<li>Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+infection+model+for+pathogenesis+and+vaccine+studies+of+murine+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intradermal infection model for pathogenesis and vaccine studies of murine visceral leishmaniasis.</a> Infect Immun. 71, 401-410 (2003).</li>
<li>Kamala, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hock+immunization%3A+a+humane+alternative+to+mouse+footpad+injections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Hock immunization: a humane alternative to mouse footpad injections.</a> J Immunol Methods. 328, 204-214 (2007).</li>
<li>Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Leishmania+expressing+luciferase+for+rapid+and+high+throughput+screening+of+drugs+acting+on+amastigote-harbouring+macrophages+and+for+quantitative+real-time+monitoring+of+parasitism+features+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice.</a> Cell Microbiol. 7, 383-392 (2005).</li>
<li>Brittingham, A., Miller, M. A., Donelson, J. E., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+GP63+mRNA+stability+in+promastigotes+of+virulent+and+attenuated+Leishmania+chagasi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Regulation of GP63 mRNA stability in promastigotes of virulent and attenuated Leishmania chagasi.</a> Mol Biochem Parasitol. 112, 51-59 (2001).</li>
<li>Roy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episomal+and+stable+expression+of+the+luciferase+reporter+gene+for+quantifying+Leishmania+spp.+infections+in+macrophages+and+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models.</a> Mol Biochem Parasitol. 110, 195-206 (2000).</li>
<li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Hardy, J., Margolis, J. J., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Biliary+Excretion+of+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Induced Biliary Excretion of Listeria monocytogenes.</a> Infect. Immun. 74, 1819-1827 (2006).</li>
<li>Lecoeur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Topical+Therapy+for+Leishmania+major+Localized+Cutaneous+Leishmaniasis+Using+a+Reliable+C57BL%2F6+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Optimization of Topical Therapy for Leishmania major Localized Cutaneous Leishmaniasis Using a Reliable C57BL/6 Model.</a> PLoS Negl Trop Dis. 1, e34-e34 (2007).</li>
<li>Lang, T., Lecoeur, H., Prina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Leishmania+development+in+their+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Imaging Leishmania development in their host cells.</a> Trends Parasitol. 25, 464-473 (2009).</li>
</ol>

El sistema de imágenes in vivo (IVIS) proporciona un método para obtener imágenes de animales enteros o en vivo modelos de infección experimental de imágenes de diferentes formas de leishmaniasis. 18,16 La spp Leishmania. los parásitos pueden ser modificados para expresar la luciferasa de luciérnaga en un nivel que se detecta en vivo con la tecnología de imagen IVIS. Una de las principales ventajas de este método es que permite la visualización no invasiva de L...

<table><tbody><tr><td>Sal potásica de D-luciferina </td><td>Reactivo</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/122796" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td>122796</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen IVIS Serie 200</td><td>Equipo</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td>Otros modelos IVIS que pueden utilizarse incluyen: Lumina II, Lumina XR, Kinetic y Spectrum. </td></tr></tbody></table>

imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos leishmania en un host en vivo

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distintas especies de<em&gt; Leishmania,</em&gt; Un protozoo parásito de la familia<em&gt; Trypanosomatidae</em&gt;, Suelen causar diferentes manifestaciones de la enfermedad humana. Las formas más comunes de la enfermedad son la leishmaniasis visceral (LV) y la leishmaniasis cutánea (LC). Los modelos de ratón de la leishmaniasis son ampliamente utilizados, pero la cuantificación de la carga de parásitos durante la enfermedad requiere murino ratones que ser sacrificados en varias ocasiones después de la infección. Cargas parasitarias son medidos ya sea por microscopía, la limitación de ensayo de dilución, o la amplificación de ADN del parásito qPCR. La<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema de imágenes (IVIS) tiene un paquete de software integrado que permite la detección de una señal bioluminiscente asociadas a las células en los organismos vivos. Tanto para minimizar el uso de los animales y para seguir a una infección de forma longitudinal en las personas, en modelos in vivo para las imágenes<em&gt; Leishmania</em&gt; Spp. causando VL o CL se establecieron. Los parásitos fueron modificados para expresar la luciferasa, y éstos se introdujeron en los ratones ya sea por vía intradérmica o intravenosa. Las mediciones cuantitativas de la bioluminiscencia de conducción luciferasa de los transgénicos<em&gt; Leishmania</em&gt; Parásitos dentro del ratón se realiza mediante IVIS. Ratones individuales se pueden visualizar varias veces durante los estudios longitudinales, lo que nos permite evaluar la variación inter-animal en la inoculación del parásito experimental inicial, y para evaluar la multiplicación de los parásitos en tejidos de ratón. Los parásitos se detectan con una alta sensibilidad en lugares cutáneos. Aunque es muy probable que la señal (fotones / segundo / parásito) es menor en los órganos viscerales profundos que la piel, pero las comparaciones cuantitativas de las señales de superficial en comparación con los sitios profundos no se han hecho. Es posible que el número de parásitos entre las partes del cuerpo no se pueden comparar directamente, aunque la carga de parásitos en los mismos tejidos pueden ser comparados entre los ratones. Ejemplos de una especie visceralizing (<em&gt; L. infantum chagasi</em&gt;) Y una especie que causa la leishmaniasis cutánea (<em&gt; L. mexicana</em&gt;) Se muestran. El procedimiento de IVIS pueden ser utilizados para el seguimiento y análisis de modelos de animales pequeños de una amplia variedad de<em&gt; Leishmania</em&gt; Especies causantes de las diferentes formas de la leishmaniasis humana.

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema de imagen se utiliza para generar mediciones cuantitativas de la infección murina con los protozoos tripanosomátidos<em&gt; Leishmania</em&gt;. Este es un método no invasivo y no letales para la detección de parásitos que expresan luciferasa en muchos tejidos en el curso de las enfermedades crónicas<em&gt; Leishmania</em&gt; Spp. infección.

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distintas especies de Leishmania, un parásito protozoario de la familia Trypanosomatidae, suelen causar diferentes manifestaciones de enfermedades humanas. Las más...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de infecciones por parásitos de leishmania en un huésped vivo. Esto se logra primero generando parásitos transgénicos bioluminiscentes. El segundo paso del procedimiento consiste en infectar ratones con parásitos de leishmania.El tercer paso del procedimiento es la obtención de imágenes bioluminiscentes de los ratones infectados mediante IVIS. El paso final del procedimiento consiste en analizar los datos bioluminiscentes. En última instancia, se pueden obtener resultados que son medidas cuantitativas de la bioluminiscencia generada por los parásitos de *Leishmania* transgénicos en ratones vivos mediante el uso de IVIS.Este método permite analizar la carga parasitaria relativa en diversas localizaciones anatómicas y en el mismo animal durante estudios longitudinales. Hola, soy Colin Fer, estudiante del programa de posgrado en inmunología de la Universidad de Iowa. Trabajo en el laboratorio de la Dra. Mary Wilson.Hola, soy Mary Wilson. Estamos en los Departamentos de Microbiología y Epidemiología de Medicina Interna de la Universidad de Iowa. También trabajamos en el Centro Médico de la VA de Iowa City.Hola, soy Lori, ama

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se muestra el método para realizar microscopía intravital del bazo con las buenas prácticas agrarias parásitos de la malaria transgénicos y la cuantificación de la movilidad del parásito y el flujo de sangre dentro de este órgano.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

Un ensayo parásito-rescate y la transformación con células THP1...

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Este video muestra un ensayo para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos derivados de la médula ósea (BMM). Las células macrófagas están infectadas con los estadios invasivos móviles y no móviles de Leishmania, promastigotes metacíclicos y amastigotes, respectivamente. Los parásitos invaden los macrófagos, se internalizan en una vacuola parasitófora y se multiplican en su interior. El crecimiento intracelular del parásito se cuantifica utilizando un microscopio tras...

Un ensayo in vitro para cuantificar el crecimiento intracelular de parásitos en macrófagos

Este artículo informa sobre un método detallado para la medición dinámica y cuantificación de la velocidad del flujo sanguíneo dentro de los vasos sanguíneos individuales de la vasculatura hepática del ratón utilizando imágenes de microscopía intravital en combinación con una metodología específica para la adquisición y análisis de imágenes.

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Aquí, presentamos un protocolo compilado para evaluar la infección cutánea de ratones con Leishmania amazonensis. Este es un método confiable para estudiar la virulencia del parásito, permitiendo una visión sistémica de la respuesta del huésped vertebrado a la infección.

In Vivo infección con Leishmania amazonensis para evaluar la virulencia del parásito en ratones

En este trabajo se describe la metodología utilizada para generar cepas de L. panamensis y L . donovani que expresan el gen de eGFP como un transgén integrado estable utilizando el sistema pLEXSY. Los parásitos transfectados se clonaron limitando la dilución, y se seleccionaron los clones con la mayor intensidad de fluorescencia en ambas especies para su posterior uso en ensayos de detección de fármacos.

Desarrollo de cepas de especies de Leishmania con expresión constitutiva de eGFP

El protocolo proporcionado aquí describe los pasos detallados para realizar estudios de eficacia de fármacos en un modelo bioluminiscente de infección por Trypanosoma cruzi , con un enfoque en la adquisición, análisis e interpretación de datos. También se proporcionan procedimientos de solución de problemas y control de calidad para minimizar los problemas técnicos.

Desmitificación de la imagen de bioluminiscencia in vivo de un modelo de ratón de enfermedad de Chagas para estudios de eficacia de fármacos

En este trabajo presentamos una evaluación longitudinal de hámsters dorados infectados por vía intraperitoneal (IP) o intragingival (IG) con L. infantum-Luc mediante imagen bioluminiscente y por PCR. Los hámsters fueron evaluados 1 día después de la infección (1 dpi), 1 semana después de la infección (8 dpi) y 3 semanas después de la infección (22 dpi) y se les practicó la eutanasia a los 50dpi y 8 meses después de la infección.

In vivo Imágenes de hámsters infectados con Leishmania infantum mediante inoculación gingival de amastigotes axénicos que expresan luciferasa

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Aprende a realizar imágenes in vivo de infecciones por Leishmania en ratones utilizando parásitos transgénicos bioluminiscentes. Este método no invasivo permite cuantificar la carga parasitaria longitudinalmente.

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

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