El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

En este artículo se describen las buenas prácticas agrarias basadas en la fluorescencia

En este video se demuestra un protocolo que es un método para medir la eficiencia y precisión de la reparación de frenos de doble cadena de ADN por NHEJ o HR en una línea celular de mamíferos. El procedimiento comienza con la generación de una línea celular que contiene una copia única integrada cromosómicamente de NHEJ o casete reportero HR. A continuación, estas células reporteras se transfectan con una mezcla de I SCE, un plásmido que expresa y rojo DS y un plásmido.

Yo sce. Una endonucleasa produce una rotura de doble cadena en la construcción reportera y DS RED sirve como control de transfección. A continuación, se analiza por fax el porcentaje de células GFP positivas y de células rojas DS positivas para cuantificar la eficacia de la NHEJ o de la HR, si se desea.

La fidelidad de la reparación se analiza rescatando los productos reporteros en E. coli y secuenciando los productos de reparación. De esta manera, la eficiencia y la fidelidad de la rotura de la cadena doble o la reparación DSB en una línea celular determinada se determina en función de la cuantificación citométrica de flujo de los eventos de reparación y la secuenciación de los productos de reparación. Este método tiene muchas ventajas sobre los métodos existentes para el análisis de la reparación de frenos de doble cuerda.

En primer lugar, este método diferencia específicamente entre una recombinación homóloga y no homóloga y de unión. Luego, el método es altamente cuantitativo, lo que permite el análisis de millones de células por citometría de flujo y luego el método no requiere un empaquetamiento extenso de las células una vez que se completa la reparación para la selección de cls resistentes a los antibióticos. Y por último, la finalización de la reparación se puede monitorear en tiempo real observando la apariencia de las células verdes.

Y este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación, como la medición de la HR y la eficiencia de reparación de HEGA en tipos de células mutantes del virus o el seguimiento de tratamientos farmacológicos. Examinar la reparación A en diferentes etapas del ciclo celular y medir la tasa de reparación tan general. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es importante lograr una buena eficiencia de transfección.

En este procedimiento. Se utilizan dos casetes reporteros para analizar la reparación de roturas de ADN bicatenario. Un casete se utiliza para examinar la unión de extremos no homólogos o la reparación de N-H-E-J-D-N-A.

El otro se utiliza para observar la recombinación homóloga o la reparación del ADN HR en el extremo no homólogo. El casete reportero de unión contiene un gen GFP con un intrón de tres kilobases diseñado a partir del gen PEM uno o GFP PEM uno. En resumen, la introducción de P one contiene un exón adenoviral flanqueado por secuencias de reconocimiento para la endonucleasa Hindi tres y I SCE one para la inducción de roturas bicatenarias.

Los sitios I SCE uno tienen una orientación invertida I SCE uno tiene una secuencia de reconocimiento no palindrómica, por lo tanto, dos sitios invertidos generan incompatibilidades. El ADN termina incompatible. Los extremos del ADN imitan mejor a los dss que ocurren naturalmente.

Un casete de NAEJ no arreglado es GFP negativo ya que el exón adenoviral interrumpe el G-F-P-O-R-F. Tras la inducción de roturas de ADN bicatenario por ISEE one, se elimina el exón adenoviral y NHEJ restaura la función del gen GFP. El casete reportero de recombinación homóloga también se basa en la construcción GFP PEM one del casete HR.

El primer exón del G FP PEM one contiene una deleción de 22 pares de bases combinada con la inserción de tres sitios de restricción. I SCE uno Hindi tres I SCE E uno. La eliminación garantiza que GFP no pueda ser reconstituido por un evento NHEJ aquí también.

Los sitios I SCE one están en orientación invertida. Por lo tanto, la digestión I SCE one deja extremos incompatibles. A la primera copia de GFP PMM uno le sigue un promotor menos un TG, menos el primer exón y la introducción de GFP M1. La construcción intacta es GFP negativa tras la inducción de una rotura de doble cadena por I sce E una digestión.

El gen GFP funcional se reconstituye por un evento de conversión génica entre las dos copias mutadas del primer exón PMM de GFP y otros tipos de reparación de DSB, como el cruzamiento de rodillas monocatenarias. Y NHEJ no reconstituirá el gen GFP. Ya que falta la segunda copia del gen GFP.

El primer codón A TG y la resolución del segundo exón por cruzamiento o arrodillamiento monocatenario no restauran la actividad de GFP. Por lo tanto, este diseño permite la detección exclusiva de la resolución por conversión génica, que es la vía HR predominante en las células de mamíferos. Para comenzar este procedimiento, utilice el kit endo free de Kyogen para preparar un stock de alta calidad de plásmido reportero NHEJ o HR, linealice 10 microgramos del plásmido y purifique el ADN de la solución de digestión.

Consulte el protocolo escrito adjunto para conocer los detalles de la preparación del plásmido. En preparación para la transfección. Asegúrese de que los fibroblastos humanos normales se mantengan en las mejores condiciones de crecimiento.

Si se parte de un vial congelado, divida las células dos veces antes de la transfección. Si se parte de una placa de confluencia, las células se dividen una vez, crecen las células hasta un 70 a 80% de confluencia. Esto tarda unos dos días para cinco veces 10 a la quinta célula plateada en una placa de 100 milímetros.

Para obtener la mejor eficiencia de transfección, lleve las células al crecimiento logarítmico. El cultivo en crecimiento activo contiene células en la etapa M, vistas como células redondeadas unidas a la superficie para la recolección de transfección aproximadamente dos veces 10 de las seis células de dos placas de 100 milímetros. Es fundamental no exceder la tripsina, las células dejan de tripsina tan pronto como el 80% de las células se han desprendido de la placa.

Vuelva a suspender las células en una solución de NHDF. Dado que las células son sensibles a la solución de NHDF, minimice el tiempo de incubación y mezcle las células suavemente. A continuación, utilice el efector de núcleo amaxa para transfectar las células con 0,5 microgramos de construcción reportera linealizada para fibroblastos humanos normales.

Estas condiciones de transfección dan como resultado la integración de una sola copia de un constructo reportero para la mayoría de los integrantes 24 horas después de la transfección a un miligramo por mililitro de genética o G 4 18. Con el fin de seleccionar las células con construcciones reporteras cromosómicamente integradas, se continúa la selección durante siete a 10 días, luego se eligen colonias individuales de G 4 1 8 resistentes o se agrupan los clones resistentes. Expanda el cultivo a aproximadamente cinco placas de 100 milímetros.

Congele tres placas para usarlas en el futuro y expanda las dos placas restantes a cinco veces 10 por la quinta celda por placa de 100 milímetros. Diez placas de cien milímetros suelen ser suficientes para cinco transfectos. Dos días después de la siembra, cuando las células que contenían la construcción reportera alcanzaron un 70 a 80% de confluencia con una mezcla de cinco microgramos de un plásmido expresivo y 0,1 microgramos de plásmido rojo DS.

Como control de la eficiencia de la transfección, utilice el efector de núcleo AM maxon para transfectar aproximadamente dos veces 10 de las seis células de un cultivo en crecimiento logarítmico. Dado que la eficiencia de DSP se mide como una relación entre GFP positivo y células rojas DS positivas, las variaciones en la mezcla de ISCE uno y plásmido rojo DS pueden afectar los resultados. La calidad del plásmido también puede afectar los resultados al cambiar la eficiencia de la transfección.

Por lo tanto, para obtener mediciones consistentes, es importante utilizar la misma mezcla de plásmidos dentro de un experimento Al mismo tiempo, prepare tres controles de calibración para los hechos de cada control. Transfecta aproximadamente dos veces 10 de las seis celdas. Los tres controles son cinco microgramos de plásmido que expresa EGFP, cinco microgramos de DS, plásmido rojo y cinco microgramos.

Plásmido de control que no expresa una proteína fluorescente. Tres días después de la transfección, verificar la eficiencia de la transfección y la expresión de las proteínas rojas GFP y DS mediante un microscopio fluorescente invertido con filtros para la detección de GFP y DS. El rojo cultiva las células durante un día adicional antes del análisis por fax, cuatro días después de la transfección cosecha las células transfectadas I SCE one y las células de control. En esta etapa, es fundamental cosechar todas las células y tener células de forma redonda.

Para lograr esto, use un tiempo de tripsinización más largo o una mayor concentración de tripsina. Examine las células bajo el microscopio para confirmar que el 99% de las células están separadas de la placa y tienen una forma redonda. Vuelva a suspender las celdas en 500 microlitros de PBS y transfiéralas a tubos de fax.

Mantenga las células en hielo y protéjalas de la luz, mientras que es posible almacenar las células en hielo durante unas horas. Para obtener los mejores resultados, analice las células inmediatamente después de la cosecha. A continuación, calibra los hechos con TFP DS RED y los controles negativos.

Ajuste el voltaje y la compensación de color para incluir todas las células fluorescentes en el análisis. Hay que tener en cuenta que la intensidad fluorescente de las muestras experimentales es menor que la de los controles. Después de calibrar los hechos con los controles, analice el recuento de células transfectadas I SCE one al menos 20.000 células para cada tratamiento para evitar posibles interferencias entre GFP y ds.

La fluorescencia roja mantiene el porcentaje de células GFP positivas o DS rojas positivas por debajo del 25%Si el porcentaje es mayor, reduzca la cantidad de DS RED o I sce E un plásmido. El porcentaje de células GFP positivas corresponde a la eficiencia de la reparación de D-N-A-D-S-P y el porcentaje de células rojas positivas DS indica la eficiencia de la transfección. Calcule la eficiencia relativa de la reparación D-N-A-D-S-P como una relación entre las células GFP positivas y las células DS rojas positivas.

Con el fin de determinar la precisión de los remedios reparados, rescate de las construcciones reporteras mediante la digestión del ADN genómico con la circularización de la enzima eco R one y su transformación en células de e-coli competentes. Este rescate es posible ya que las construcciones originales contienen un origen bacteriano de replicación analizado por restricción, digestión y secuenciación. Estos son hechos típicos, resultados de las transecciones de control y de los experimentos NHEJ y HR.

La intensidad fluorescente y el número de células fluorescentes son menores en las células transfectadas I SCE one en comparación con los controles. La diferencia en la señal de fluorescencia se debe a la diferencia en el número de copias de las construcciones GFP y DS RED en estas células. Cada celda del experimento contiene una copia de la construcción reportera integrada.

Por lo tanto, los eventos de reparación exitosos reconstituyen el gen GFP en una fracción de las células. La eficiencia de NHEJ y HR se calcula como una relación entre GFP positivo y DS glóbulos positivos. NHEA es un proceso más eficiente que HR en células humanas, en fibroblastos humanos, la eficiencia de NHEJ es típicamente de 0.6 a 1.3 y la eficiencia de HR es de 0.05 a 0.3.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la reparación del ADN exploraran el papel de varios factores en HEG y HR y estudiaran la cinética y las regulaciones de NHEG y HR en células de mamíferos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la eficiencia y la precisión de HR y GJ en células de mamíferos utilizando un ensayo fluorescente.