Encyclopedia of Experiments: Biology
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-在注射前一天晚上将两条雌性鱼和两条雄性鱼放入一个分开的养殖池中。第二天早上，取出分隔线，让鱼繁殖，直到你观察到鱼缸底部的卵子。 收集鸡蛋，用含有甲基蓝（杀菌剂）的E3介质清洗。观察显微镜下的卵子，取出未受精卵。 未受精卵有清晰的蛋黄膜，而受精卵有深色蛋黄膜。
将 10个胚胎放在单独的培养皿中，作为未弹出的控制。 使用转移移液器，在室温下将胚胎对齐到微注射板的槽中，并将其置于显微镜下。轻轻地将微注射针穿过胆汁插入蛋黄，然后慢慢注入含有酚红色等标记物的利害化合物。细胞质流使化合物扩散到胚胎细胞中。
注射后，在E3介质中以28摄氏度的乙烯蓝色生长胚胎。 继续检查胚胎的健康状况。取出任何死亡或发育异常的胚胎，并每天更换介质。 在下列协议中，我们将使用微注射将核糖核蛋白（RNP）复合物输送到斑马鱼胚胎中。
- 首先，准备斑马鱼受试者在实施文本协议中描述的注射前一天晚上繁殖。然后将 Cas9 蛋白质和 sgRNA以二比一的比例组合在一起。在室温下将溶液孵化五分钟，而Cas9和sgRNA形成核糖核蛋白复合物。然后在足够的RNase自由水中加入0.5微升 2.5% 苯酚红色溶液，实现 5微升的最终体积。
要准备注射针，使用微皮拉拔器拉一毫米玻璃毛细管。 然后用剃须刀刀片切开生成的玻璃针的尖端，以获得有角度的开口。 将针头放在连接到微注射器的微脉冲器中。使用光显微镜调整注射压力，直到针头在培养皿中持续注射一纳米溶液。
-在进行胚胎微注射之前，使用染料溶液练习准备针头和注射控制胚胎，并记录发育24小时后的存活率。与未注入的控制相比，您应该能够获得超过90%的存活率。
-接下来，选择10至15个胚胎作为控制种群，并把它们放在一个单独的标签Petry盘中。使用移植移液器，小心地将剩余的胚胎排在室温注射板上。 在解剖显微镜下，将溶液的一纳米化物注射到每个胚胎的蛋黄囊中。然后将注射的胚胎返回到标记的培养皿中，用1X E3介质覆盖它们，用甲基蓝色覆盖它们。 将注射的胚胎放入28摄氏度的孵化器中24小时。然后检查注射的胚胎，以去除死亡或发育异常的个体。
