Cocultivo 3D de células de cáncer de pulmón con CAFs: un sistema modelo in vitro para estudiar la progresión tumoral

- En los cocultivos 3D, varios tipos de células crecen juntas en matrices como una matriz de membrana basal, que imita el microambiente natural de la matriz extracelular, lo que facilita las interacciones célula-célula y célula-matriz. Para establecer un cocultivo 3D incrustado, prepare una suspensión uniforme de fibroblastos asociados al cáncer o CAF y células de cáncer de pulmón tomadas en una proporción de dos a uno, en la matriz de la membrana basal. Mantenga la suspensión en hielo para evitar la solidificación de la matriz a temperatura ambiente.

Transfiera un volumen adecuado de suspensión a una placa de cultivo celular. Incubar a 37 grados centígrados durante el tiempo requerido para co-incrustar las células en la matriz. Para establecer un cocultivo 3D superpuesto, prepare una suspensión de células de cáncer de pulmón en la matriz de la membrana basal, en la densidad celular deseada. Mantenga la suspensión en hielo. Pipetear un volumen apropiado de esta suspensión de matriz celular en una placa de cultivo celular. Incubar a 37 grados centígrados para establecer el monocultivo de células cancerosas incrustadas.

Posteriormente, transfiera el volumen deseado de CAFs suspendidos en los medios de cultivo preferidos, sobre las células cancerosas incrustadas. En los cocultivos 3D, los CAF mejoran la formación de esferoides de las células cancerosas y atraen a las células cancerosas, lo que da como resultado estructuras similares a lágrimas. En este protocolo, co-cultivaremos células de cáncer de pulmón TUM622 y CAFs para estudiar su interacción.

- Después de preparar las suspensiones celulares de TUM622 y CAFs, como se describió anteriormente, cuente la densidad celular CAF mezclando 10 microlitros de suspensión celular con 10 microlitros de azul de tripán. Agregue 10 microlitros de la mezcla a cada una de las dos cámaras en un hemocitómetro para contar y calcular la densidad celular. Para coincrustar células TUM622 y CAF en la matriz de membrana basal, primero calcule el número deseado de células utilizadas para el recubrimiento, en función de la información de densidad celular. Los CAF se siembran en una proporción de 2 a 1 de las células TUM622. Transfiera el volumen calculado de TUM622, así como la suspensión de las celdas CAF, al mismo tubo de centrífuga. Gire hacia abajo y aspire todo el medio. Vuelva a suspender en la matriz de la membrana basal y coloque 310 microlitros de la mezcla en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Para la inmunofluorescencia, transfiera 60 microlitros de mezclas de TUM622 y CAF a los portaobjetos de la cámara como se describió anteriormente.

Para co-cultivar TUM622 con CAFs superpuestos en la matriz de membrana basal, primero configure el monocultivo TUM622 como se describió anteriormente. Transfiera el doble de la cantidad de suspensión de CAF a un tubo de centrífuga y gire a 300 veces 'g' durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender los CAFs en un mililitro de medio de cultivo 3D. Transfiera la suspensión de CAF de un mililitro al pocillo que contiene las celdas TUM622 incrustadas.