Método de la gota colgante: una técnica para generar esferoides de melanoma en 3D

- Los esferoides son modelos tridimensionales de cultivo celular in vitro que imitan la arquitectura tumoral in vivo y ayudan a estudiar las interacciones intratumorales. Para configurar el cultivo, primero prepare una suspensión unicelular de células de melanoma en su medio apropiado. A continuación, localice pequeños volúmenes de esta suspensión celular, suficientemente separados en la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo estéril y no adhesiva. Invierta con cuidado la tapa y colóquela en la base de la placa de cultivo que contiene PBS para crear una cámara de hidratación. Incubar la placa en condiciones adecuadas.

La humedad del PBS evita la evaporación de los medios de las gotas colgantes. Refresque las gotas reemplazando unos pocos microlitros de medio. Debido a la tensión superficial, las gotas mantienen su forma esférica y permanecen suspendidas de la superficie interna de la placa. Las fuerzas gravitacionales facilitan que las células permanezcan en suspensión sin extenderse, sino que se agreguen para formar esferoides tridimensionales dentro de las gotas. Finalmente, enjuague las gotas con PBS para recolectar los esferoides. Recójalos en una placa de cultivo no adhesiva.

En el siguiente protocolo, demostraremos la generación de esferoides tridimensionales de células de melanoma 451-LU mediante el método de gota colgante.

- Para empezar, cultivar células de melanoma 451-LU utilizando medio RPMI que contenga un 10% de FCS, de acuerdo con los protocolos generales de cultivo celular. Para generar esferoides de melanoma, lave las células de melanoma cultivadas en PBS. A continuación, añade 5 mililitros de 1x Tripsina-EDTA en PBS. Incubar durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Añadir 5 mililitros de RPMI que contengan un 10% de FCS para neutralizar la tripsina. Luego, transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos para recolectar las células. Vuelva a suspender el pellet de celda en RPMI que contenga un 10% de FCS.

A continuación, cuente las células y diluya la suspensión celular hasta una concentración final de 10.000 células por mililitro. Utilice una pipeta electrónica múltiple para hacer puntos de suspensión celular de 40 x 25 microlitros en la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo celular estéril y no adhesiva de 10 centímetros.

A continuación, dé la vuelta a la tapa con un movimiento rápido y suave y colóquela en la placa de cultivo celular que contiene 5 mililitros de PBS. Cultive los platos colgantes a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante 10 a 14 días.

Cinco días después de la detección inicial de gotas, use un dispensador electrónico para agregar 10 microlitros de RPMI que contengan 10% de FCS a cada gota. Después de 10 a 15 días, coseche los esferoides enjuagándolos suavemente de la tapa con PBS. Recoja los esferoides en una placa de cultivo celular nueva y no adhesiva.