Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Comience con células madre pluripotentes inducidas humanas o suspensión de hiPSC en medios. Agregue un par de nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción o plásmidos que codifican TALEN. Suplementación con un plásmido donante portador de un gen de proteína fluorescente, acoplado a un gen de resistencia a antibióticos, con brazos de homología adyacentes para la alineación específica con los loci diana.

Electroporar la mezcla para generar poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la internalización de plásmidos. Una vez dentro de las células, los plásmidos que codifican TALEN se procesan, produciendo TALEN, proteínas quiméricas compuestas por un dominio de unión al ADN TALE específico del sitio fusionado con un dominio de escisión de endonucleasa de restricción FokI no específico.

Cada monómero TALEN a través de su dominio de unión al ADN, que comprende módulos de repetición de aminoácidos en tándem, reconoce y se une a los loci objetivo, un módulo por nucleótido, en cada hebra de ADN en orientaciones opuestas, separadas por una secuencia espaciadora. Luego, los dominios FokI se dimerizan y escinden el ADN dentro de la secuencia espaciadora, creando roturas de doble cadena con voladizos.

En presencia de un plásmido donante que contiene brazos de homología complementarios a las regiones que flanquean el sitio escindido, se produce la reparación dirigida por homología utilizando la secuencia homóloga como molde para la síntesis de reparación del ADN para salvar las roturas de doble cadena. Después de la ligadura de las muescas, la proteína fluorescente interviniente y los genes de resistencia a los antibióticos se integran en el genoma del huésped.

Trate las hiPSC, sembradas en una capa de células alimentadoras para apoyar el crecimiento, con medios que contengan antibióticos. El gen de resistencia a los antibióticos sin promotor, impulsado por un promotor endógeno aguas arriba, facilita la selección de células editadas por TALEN.