Edición génica mediada por transposones PiggyBac en iPSC humanas: un procedimiento para integrar genes de interés en iPSC humanas utilizando el sistema de transposones PiggyBac

Comience con una suspensión de células madre pluripotentes inducidas por el hombre, hiPSC, en un tampón de electroporación adecuado. Agregue una solución que consista en plásmidos que codifican para la transposasa PiggyBac y plásmidos de donantes. Electroporate la mezcla.

Los pulsos eléctricos permeabilizan transitoriamente las membranas celulares, facilitando la absorción celular de plásmidos. Los plásmidos donantes comprenden repeticiones terminales invertidas específicas de transposones, ITR, que son complementos invertidos entre sí, flanqueadas por repeticiones TTAA que enmarcan la proteína diana y los genes de resistencia a los antibióticos.

Las proteínas transposasas PiggyBac expresadas crean muescas en los extremos 3' de los ITR, internas a las repeticiones TTAA. Los grupos 3'-hidroxilo expuestos atacan el nucleótido de la hebra complementaria dentro del ADN flanqueante, formando horquillas TTAA en los extremos del transposón, liberando así la construcción del transposón del plásmido.

Las transposasas resuelven las horquillas para formar voladizos TTAA en los extremos 5' de la construcción del transposón. Las transposasas crean además roturas de doble cadena en la secuencia TTAA en el genoma del huésped. Los extremos del transposón 3'-hidroxilo liberados atacan la secuencia TTAA en los extremos escalonados, lo que resulta en la unión covalente de la construcción del transposón al genoma del huésped, dejando espacios de una sola cadena que flanquean la construcción del transposón. Estos espacios en el ADN del huésped están ligados, lo que lleva a la integración estable de la construcción del transposón.

Trate las hiPSC sembradas en una placa recubierta de proteínas de matriz extracelular con medios que contengan antibióticos. El gen de resistencia a los antibióticos, impulsado por el promotor aguas arriba, permite la selección de células editadas genéticamente.