Integración de genes dirigidos mediada por TALEN: uso de nucleasas específicas de secuencia modificadas para la inserción precisa de genes de proteínas fluorescentes en hiPSC

Comience lavando los cultivos de iPSC una vez cada uno con PBS, luego agregue 1 mililitro de reactivo de disociación celular suave a 37 grados Celsius a cada pocillo e incube las células a 37 grados Celsius durante aproximadamente 5 minutos. Cuando más del 50% de las células se hayan disociado del recipiente de cultivo, utilice una pipeta P1000 para interrumpir mecánicamente los grupos de células restantes o las células adheridas. A continuación, añada 2 mililitros de medio E8 a cada pocillo y utilice una pipeta de 10 mililitros para desagregar aún más los cultivos en suspensiones unicelulares.

Ahora, vierta las células recolectadas en un tubo cónico de 15 mililitros y gírelas hacia abajo. Vuelva a suspender el pellet en una cantidad mínima de medio E8 para contar. Luego, después de confirmar la viabilidad de los cultivos por exclusión de azul de tripán, así como su disociación suficiente, transfiera 3 millones de células a cada uno de los dos tubos cónicos de 15 mililitros.

Mientras las células se centrifugan, configure el sistema de electroporación en el programa específico del tipo de célula para la línea de células madre embrionarias humanas, H9. A continuación, añada 10 microgramos del donante de recombinación homóloga solo a 1 pellet para la muestra de control, y 10 microgramos del plásmido donante de recombinación homóloga junto con 5 microgramos de cada plásmido TALEN para la muestra experimental.

A continuación, agregue 100 microlitros de solución de transfección de células primarias P3 completa a temperatura ambiente a cada uno de los gránulos de control y experimentales, y vuelva a suspender las células. Transfiera las muestras a cubetas individuales y, a continuación, electropore las muestras. Inmediatamente después de la transfección, agregue 500 microlitros de medio E8 a temperatura ambiente a cada cubeta y, a continuación, transfiera las muestras de iPSC seccionadas gota a gota a platos individuales de 10 centímetros que contengan fibroblastos embrionarios de ratón DR4.