Silenciamiento génico in vitro basado en transfección inversa de siRNA: un procedimiento para administrar pequeño ARN interferente en células cultivadas para inactivar la expresión génica diana

Pipetear el siRNA con un medio esencial mínimo mejorado para mezclar e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Añada el reactivo de transfección y el medio esencial mínimo mejorado al siRNA y pipetee para mezclar. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue la mezcla de transfección a cada pocillo de la placa recubierta de colágeno.

Lave las celdas en la placa de Petri de 100 milímetros dos veces con DPBS. Agregue tripsina 5X a las células, asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 segundos y retire con cuidado la tripsina. Incubar la placa de Petri durante 5 a 10 minutos a 37 °C en la incubadora.

Luego, golpee el plato para separar las células, evitando daños en las células. Añadir 10 mililitros de DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de FCS y 1% de penicilina y estreptomicina, para neutralizar la tripsina. Pipetear cuidadosamente el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular.

Cuente las células utilizando una cámara de recuento Malassez o un contador de células automatizado, y ajuste la concentración de las células a 6,25 x 10⁵ células/mL de medio. Siembre 800 microlitros de la suspensión celular por pocillo de una placa de 12 pocillos, o 400 microlitros de la suspensión celular por pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga la mezcla de transfección.

Incube las placas en una incubadora de cultivo celular y no las moleste durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de FCS y 1% de penicilina y estreptomicina, y devuelva las células a la incubadora.