Knockout de múltiples genes mediado por concatemeros CRISPR: una técnica para eliminar simultáneamente múltiples genes mediante una vía de unión de extremos no homóloga en células intestinales de ratón

Comience este procedimiento agregando 9 mililitros de medio sérico reducido al tubo de 15 mililitros que contiene la suspensión celular y centrifugue a 400 G durante 3 minutos a temperatura ambiente. Retire todo el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en una solución de electroporación. Agregue una cantidad total de 10 microgramos de ADN a dos tubos nuevos. A continuación, añada la solución de electroporación hasta un volumen final de 100 microlitros y mantenga la mezcla de célula y ADN en hielo.

Transfiera la mezcla de célula y ADN a la cubeta de electroporación. Coloque la cubeta en la cámara del electroporador. Mida la impedancia presionando el botón apropiado en el electroporador y asegúrese de que sea de 0.030 a 0.055 ohmios. Realice la electroporación de acuerdo con la configuración indicada en el protocolo de texto. Agregue 400 microlitros de tampón de electroporación más un inhibidor de ROCK a la cubeta y luego transfiera todo su contenido a un tubo de 1,5 mililitros.

Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se recuperen. Después de 30 minutos, gire a 400 g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros por pocillo de matriz basal. Siembre aproximadamente 1 x 10⁴ a 1 x 10⁵ células por pocillo en una placa de 48 pocillos, y agregue EGF más un inhibidor de Noggin GSK-3, un inhibidor de ROCK y un medio de dimetilsulfóxido al 1,25%. Incubar a 37 grados centígrados.