Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para enumerar bacteriófagos

Para enumerar bacteriófagos a través de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa, qPCR, obtenga un cóctel de reacción de qPCR que contenga ADN polimerasa Taq, cebadores, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP) y moléculas de colorante indicador fluorescente en un tampón optimizado. Transfiera a los pocillos de una placa qPCR.

Agregue bacteriófagos tratados térmicamente. El tratamiento térmico libera el ADN de los bacteriófagos de las partículas de bacteriófagos. Selle la placa, evitando la evaporación de la mezcla. Cargue la placa en el sistema qPCR, estableciendo las condiciones de ciclo adecuadas.

El calentamiento a altas temperaturas desnaturaliza el ADN bicatenario en hebras simples. También activa la ADN polimerasa Taq. El recocido hace que los cebadores específicos de la secuencia se unan a las hebras complementarias de ADN de bacteriófagos. La extensión permite que la ADN polimerasa Taq activada agregue dNTP al extremo 3' del cebador, extendiendo la hebra de ADN en crecimiento en la dirección de 5' a 3'.

Las moléculas de colorante se intercalan en el ADN bicatenario recién sintetizado, lo que provoca un aumento de la intensidad de la fluorescencia. Cada ciclo de PCR duplica la cantidad de ADN objetivo, aumentando la intensidad de la fluorescencia.

Determine el valor del ciclo umbral, Ct, en el que la fluorescencia medida supera el nivel de fondo.

El valor de Ct está inversamente relacionado con la cantidad inicial de ADN, con cada genoma de bacteriófago equivalente a una partícula de bacteriófago, lo que facilita la cuantificación de bacteriófagos a partir de la curva estándar de ADN de bacteriófago.

Después de la amplificación, realice un análisis de la curva de fusión, aumentando gradualmente la temperatura de reacción. A una temperatura de fusión específica, la mitad del ADN se separa en hebras individuales, liberando moléculas de tinte y causando una disminución repentina de la fluorescencia.

Una temperatura de fusión distinta, única para el producto qPCR, valida la especificidad del producto.