PCR digital basada en chip en tubo para la cuantificación de variantes de un solo nucleótido

La reacción en cadena de la polimerasa digital, o dPCR, es útil para cuantificar variantes de un solo nucleótido, o SNV, una mutación en la que la sustitución de un solo nucleótido en una posición específica del genoma crea dos variaciones o alelos de nucleótidos.

Para comenzar la cuantificación mediante la técnica de dPCR con chip en un tubo, tome una muestra de ADN que contenga SNV, el alelo mutante y el alelo de tipo salvaje correspondiente. Agregue una mezcla que contenga una enzima ADN polimerasa termoestable, dNTP y cebadores.

A continuación, agregue sondas de oligonucleótidos específicos de alelos, marcadas con reporteros de fluorescencia de diferentes colores para distinguir entre los alelos, y una molécula extingudora. La proximidad del extintor al reportero suprime su fluorescencia.

Partición de la solución en las cámaras de reacción de un chip microfluídico. Cada cámara que contiene un alelo sirve como un recipiente de reacción independiente.

Coloque el tubo con el chip dentro de un termociclador e inicie la reacción. A alta temperatura, el ADN bicatenario se desnaturaliza en monocatenarias. Bajar la temperatura para recocer los cebadores y las sondas de oligonucleótidos a sus regiones complementarias.

A una temperatura de extensión adecuada, la ADN polimerasa extiende los cebadores y escinde la sonda. La distancia desde el extintor permite la emisión de fluorescencia del reportero.

Lea las señales de fluorescencia de diferentes colores y cree un gráfico de posición para detectar las cámaras que contienen los alelos.

Para determinar la frecuencia del alelo mutante, la fracción de alelo variante, calcule la proporción de cámaras que contienen el alelo mutante frente al alelo de tipo salvaje.