Ensayo de transferencia de puntos para cuantificar el genoma viral

Para cuantificar el ADN viral mediante el ensayo de transferencia de puntos, comience con una suspensión de ADN viral aislada. Tratar con una solución alcalina para desnaturalizar el ADN bicatenario en monocatenarios para su posterior hibridación.

Ensamble el aparato de mancha de puntos con una membrana de nailon prehumedecida. Cargue ADN viral desnaturalizado y soluciones de ADN plasmídico estándar linealizado en los pocillos. Aplique un vacío adecuado, facilitando la transferencia efectiva de ADN monocatenario viral cargado negativamente y la unión a la superficie de la membrana cargada positivamente a través de interacciones electrostáticas, formando patrones de puntos.

Después de la ejecución, lave la membrana con tampón de citrato de sodio, lo que ayuda a mejorar la sensibilidad del ensayo. Después del secado, exponga la membrana a la luz ultravioleta, entrecruzando el ADN borrado con la membrana.

Agregue a la membrana un fragmento de ADN no heterólogo desnaturalizado por calor y una suspensión de sonda de ADN marcada con fósforo radiactivo específico del genoma viral en un tampón de hibridación. Incubar, facilitando la hibridación.

Los fragmentos de ADN actúan como agentes bloqueantes, uniéndose a las regiones restantes de la membrana, minimizando la unión inespecífica de la sonda. La sonda radiactiva se hibrida con la secuencia complementaria en el ADN monocatenario viral.

Lave con tampón de lavado para eliminar las sondas no hibridadas. Utilizando el sistema de escaneo de imágenes de fósforo, cuantifique las señales radiactivas emitidas por las sondas radiactivas hibridadas con el genoma viral en la membrana, para obtener señales de dot blot.

A partir de la curva estándar, la intensidad de la señal de cada punto en la membrana se puede utilizar para calcular la cantidad de ADN viral en la muestra.