Transferencia de puntos de 5-metilcitosina para determinar el grado de metilación del ADN

La metilación del ADN es una modificación epigenética que implica la adición de un grupo metilo a la base de citosina del ADN para formar 5-metilcitosina. Esta modificación altera la expresión génica.

Para cuantificar la metilación del ADN a través de dot-blot, tome muestras de ADN genómico derivadas de condrocitos humanos en varias etapas de desdiferenciación que exhiben diferentes niveles de citosina metilada.

Trata las muestras de ADN con hidróxido de sodio, un álcali fuerte, y caliéntalas. Este tratamiento rompe los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN, lo que resulta en la desnaturalización del ADN. Agregue acetato de amonio para neutralizar el álcali, evitando la degradación excesiva del ADN.

Tome una membrana de nailon y localice muestras de ADN desnaturalizado como puntos. El ADN cargado negativamente se une a la membrana de nailon cargada positivamente a través de interacciones electrostáticas, lo que resulta en su secación en el soporte sólido.

Trate la membrana seca con un tampón de bloqueo para evitar la unión inespecífica. A continuación, agregue anticuerpos anti-5-metilcitosina a la membrana e incube. Estos anticuerpos se unen exclusivamente a la citosina metilada en el ADN.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos y agregar anticuerpos secundarios conjugados con enzimas quimioluminiscentes que se unen específicamente a los anticuerpos primarios.

Agregue un sustrato quimioluminiscente a la membrana. La enzima del anticuerpo reacciona con el sustrato para producir quimioluminiscencia, produciendo puntos de varias intensidades.

Tome una imagen de la membrana y mida las intensidades de los puntos, que corresponden al grado de metilación del ADN en cada muestra.