Dot Blot cuantitativo para estimar las proteínas diana en un lisado de tejidos

El dot blot cuantitativo, o QDB, es una técnica útil para cuantificar la concentración de proteínas objetivo en una muestra. Una vez que la muestra se inmoviliza en una membrana polimérica, las proteínas se pueden detectar mediante inmunotransferencia.

Para comenzar, tome una placa QDB, una placa de pocillos múltiples con una membrana de nitrocelulosa unida al fondo de cada pocillo. Agregue la muestra, un lisado de tejido que contiene la proteína objetivo, en el centro de la membrana dentro del pocillo.

Deje que la muestra se seque. La proteína diana se une a la membrana a través de interacciones no covalentes.

Agregue una solución de bloqueo. Las proteínas de la solución se adhieren a los sitios no unidos de la membrana, evitando la unión inespecífica de los reactivos de detección.

A continuación, añada una solución que contenga anticuerpos primarios que se unan a la proteína diana de la muestra. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

A continuación, añada una solución de anticuerpos secundarios. Estas moléculas, marcadas con una enzima peroxidasa, se unen a los anticuerpos primarios unidos a proteínas. Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos.

Finalmente, agregue una solución que contenga un sustrato quimioluminiscente y peróxido de hidrógeno. Utilizando peróxido de hidrógeno, la peroxidasa unida a anticuerpos oxida el sustrato y emite luz. Con un lector de placas, mida la intensidad de luminiscencia de la muestra.

Genere una curva de luminiscencia estándar utilizando una dilución en serie con concentraciones conocidas de la proteína objetivo. Traza el valor de luminiscencia medido de la muestra en la curva para determinar la concentración de proteína objetivo.