Western Blotting cuantitativo para estimar los niveles de expresión de proteínas

La Western blot cuantitativa, una técnica basada en la normalización total de proteínas, es útil para cuantificar los niveles de expresión de proteínas objetivo.

Para comenzar, cargue el lisado de tejido en los pocillos de un gel de gradiente de poliacrilamida. El lisado contiene la proteína diana, junto con otras proteínas celulares.

Haga funcionar el gel a un voltaje adecuado para la separación electroforética de las proteínas de la muestra a lo largo del gradiente. Al finalizar, coloque el gel encima de la membrana polimérica de una pila de transferencia.

Aplique una corriente eléctrica para transferir las proteínas separadas a la membrana. A continuación, coloque la membrana en una tinción fluorescente de proteínas totales. Las moléculas de colorante cargadas en la tinción se unen electrostáticamente a todas las proteínas de la membrana.

Agregue una solución de bloqueo. Por lo tanto, las proteínas de la solución se unen a la membrana. Evitar la unión inespecífica de los reactivos de detección. Agregue un anticuerpo primario que se una solo a la proteína diana. Luego, agregue un anticuerpo secundario, marcado con un fluoróforo, que se adhiera al anticuerpo primario.

Excite la muestra con un láser. Registre la fluorescencia emitida por las moléculas de colorante de la tinción de proteína total y los fluoróforos unidos a anticuerpos en sus longitudes de onda correspondientes.

Para calcular el valor de carga de proteína normalizado, divida la señal de proteína total de cada carril por el valor más alto. Divida la señal de la proteína objetivo por el valor de carga normalizado correspondiente para determinar la expresión relativa de la proteína objetivo.