Western Blotting unicelular para determinar la heterogeneidad celular

Los sitios de inflamación contienen varias células inmunitarias, incluidos monocitos, macrófagos y leucocitos.

Para identificar una población celular heterogénea mediante Western blot de una sola célula, tome un chip de transferencia prehidratado, que consiste en un gel de poliacrilamida fotoactivable en forma de bloques. Cada bloque tiene numerosos micropocillos. Al crear patrones en varios bloques, se capturan varias celdas en paralelo.

Agregue una suspensión que contenga una población celular heterogénea. Las dimensiones del pozo permiten que las celdas individuales se asienten. Sumerja el chip en una cámara de electroforesis llena de un tampón adecuado. Las moléculas de detergente en el tampón rompen la membrana de la célula, liberando contenido celular.

Aplica un campo eléctrico. Las proteínas liberadas migran a través del gel, separándose en bandas de tamaño distinto. Lave el chip con un tampón de lavado para eliminar las moléculas no unidas específicamente, dejando solo las proteínas celulares, incluidas las proteínas marcadoras deseadas.

Exponer el gel a la luz ultravioleta, activando su superficie e inmovilizando las proteínas.

Agregue un cóctel de anticuerpos primarios que se unen específicamente a las proteínas marcadoras distintivas de cada tipo de célula, formando complejos proteína-anticuerpo primario. Dispensar una mezcla de anticuerpos secundarios marcados con fluorescente, que se unen a sus respectivos anticuerpos primarios, marcando la proteína marcadora específica de la célula correspondiente.

Coloque el chip en un escáner. Mida la intensidad de fluorescencia que es proporcional al nivel de expresión del marcador de proteína correspondiente específico para una sola célula de la suspensión celular de muestra.