Ensayo de Western Blot quimioluminiscente para el procesamiento de proteínas

CD95, un receptor de la muerte, se une a sus anticuerpos agonísticos, desencadenando el ensamblaje de un complejo de señalización inductor de la muerte, o DISC, un complejo multiproteico que recluta procaspasa 8. En el DISC, la procaspasa 8 se dimeriza y procesa para formar varios productos de escisión intermedios y, finalmente, una forma activa que inicia la apoptosis.

Para analizar el procesamiento de la caspasa-8 utilizando Western blot quimioluminiscente, se toma un lisado que contiene productos de escisión intermedios asociados a DISC de la caspasa 8 en un tubo. Compleméntelo con anticuerpos anti-CD95 capturados en perlas de proteína A-agarosa. Los anticuerpos anti-CD95 se unen al componente DISC, CD95, formando complejos proteicos.

Cargue la muestra en un gel de poliacrilamida SDS para separar los intermedios de caspasa 8 inmunoprecipitados de diferentes tamaños como bandas distintas. Coloque el gel sobre una membrana secante y aplique una corriente eléctrica. Los intermedios de caspasa 8 salen del gel y pasan a la membrana secante.

Trate la membrana con una solución que contenga proteínas bloqueantes para saturar los sitios de unión a proteínas, evitando uniones inespecíficas.

Agregue una solución de anticuerpos primarios, que se unen a los productos de caspasa-ocho en un sitio específico.

Agregue anticuerpos secundarios marcados con enzimas que se unan específicamente a la región Fc complementaria del anticuerpo primario para formar un complejo de producto de escisión de caspasa-ocho-anticuerpo primario-anticuerpo secundario.

Agregue un sustrato quimioluminiscente que reaccione con la enzima secundaria conjugada con anticuerpos y emita luz. La intensidad de la luz emitida se correlaciona con la cantidad de producto de escisión de caspasa-ocho.