PCR digital basada en chip en tubo para la cuantificación de variantes de un solo nucleótido

Agregue cebadores, sondas y ADN genómico previamente diseñados a una nueva tira de 8 tubos, para lograr un volumen total de 15 microlitros. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Agregue la plataforma de carga a las virutas construidas en la nueva tira de 8 tubos y luego coloque la tira de tubos en el cargador automático. Asegúrese de que haya un contacto entre las virutas y la plataforma de carga. A continuación, coloque el deslizador de carga en la plataforma y use un tope para mantener el deslizador fuera del cargador. Pipetee 15 microlitros de la mezcla de PCR cerca de la punta del control deslizante y, a continuación, presione el botón del cargador para hacer funcionar el cargador durante 1 minuto.

Retire la tira de tubos del cargador después de la carrera y colóquela en el potenciador de sellado. Empuje con cuidado la tapa deslizante y el borde de la tapa superior. Haga funcionar el potenciador de sellado durante aproximadamente 2 minutos. Si el sellado está incompleto, indicado por un charco de líquido, repita la ejecución durante un minuto más.

Agregue 230 microlitros de líquido de sellado a los tubos. Coloque la tira de tubos en el termociclador y ejecute la PCR como se describe en el protocolo. Si hay una distribución desigual de particiones positivas, ajuste la temperatura o la duración de la PCR.

Para detectar y analizar la intensidad de fluorescencia de los productos de PCR, coloque la tira de tubo en la plantilla de detección y agregue 6 mililitros de agua destilada. Elimine las burbujas de aire visibles con la punta de una pipeta.

Cargue la plantilla en el detector. En el software de detección, seleccione las pestañas "Fluorescencia", "Experimento" y luego "Muestra/NTC", y haga clic en el botón "Ejecutar" para iniciar la ejecución. Después de completar la ejecución, confirme el gráfico de posición, el histograma y el diagrama de dispersión 2D.

Para recoger el producto PCR, retire el líquido de sellado del tubo. Agregue 100 microlitros de tampón TE y haga vórtice vigorosamente durante 30 segundos. Centrifugar brevemente los tubos en una centrífuga de mesa y proceda como se describe en el protocolo de texto, para terminar de recolectar el producto de PCR.