La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

Hola, mi nombre es Brian Luna. Hoy estoy aquí en la Universidad de California en Irvine, donde vengo del Laboratorio James. Hoy les hablaré sobre las inyecciones de ARN de doble estratificación en mosquitos hembra adultos de tipo gyp de los ochenta.

Por lo tanto, el procedimiento consiste en usar una configuración manual e inyectar las hembras adultas en el tórax. Doble hebra. Las inyecciones de ARN se pueden utilizar para derribar numerosos genes en nuestro laboratorio. Específicamente, lo estamos usando para derribar genes relacionados con la biosíntesis de esteroides.

Ahora les voy a hablar sobre la preparación de las agujas. Ahora preparo las agujas usando estos tubos capilares de vidrio de silicato de potro. Ahora estos capilares se extraen en nuestro extractor de microinyección Sutter, y el siguiente paso después de que se hayan extraído las agujas es calibrarlos con agua.

El siguiente paso en este proceso es la calibración de las agujas. Entonces, una vez que se han extraído las agujas del Sutter Polar, salen con un aspecto, por lo que el producto final tendrá las agujas claramente marcadas con un marcador sharpie negro. Ahora, con el fin de estandarizar las marcas, cada aguja se carga con una cantidad determinada de volumen mediante una micropipeta.

La calibración de las agujas es, es importante, o de lo contrario no sabremos la concentración o el volumen exacto que estamos inyectando en cada mosquito. Para el propósito de esta demostración, he cargado los tubos capilares con un colorante alimentario. En lugar de una típica suspensión de ARN de doble cadena, el doble tren, el ARN, se puede cargar en las agujas insertando las agujas en la solución y la acción capilar caerá, dejará caer el fluido.

Ahora voy a hablarles sobre nuestra configuración de inyección. Está compuesto por una jeringa de 50 mililitros, un conjunto de grifo de serie conectado a una manguera de goma y un adaptador capilar de vidrio. El conjunto del grifo de serie se puede ajustar a tres posiciones separadas.

Esta primera posición es la posición de reposo. La segunda posición está en la posición de inyección, y la tercera posición se usa para llenar la jeringa con aire, para que la presión aumente la presión para la inyección. Por lo tanto, durante la inyección, los mosquitos se mantienen en hielo para mantenerlos dormidos.

Después de la inyección, lo mejor que puede hacer es mantenerlos a temperatura ambiente para aumentar la capacidad de supervivencia. Por lo tanto, esto se hace simplemente usando una taza común como esta y una pipeta de mil microlitros. La punta de la pipeta se corta y luego se inserta en la copa, y el producto final tiene este aspecto.

Encima de la taza, colocamos una, una red de malla y una tapa tapa. Y ahora esto solo permite que el aire entre y salga de las tazas y evite que algunos mosquitos se vayan. Los mosquitos no saldrán volando de la punta de la pipeta que se insertó en la copa.

Ahora estamos casi listos para las inyecciones. Con el ARN de doble cadena. El siguiente paso es anestesiar a los mosquitos con CO2 y colocar los mosquitos en hielo para mantenerlos dormidos.

Ahora estamos listos para los mosquitos. El primer paso de este proceso es llenar, llenar la jeringa con aire. Una vez hecho esto, la válvula se ajusta a la posición de reposo.

Así que aquí estoy a punto de insertar la aguja en el tórax del mosquito. El siguiente paso de este proceso es girar la válvula a la posición de inyección e inyectar la cantidad deseada de volumen. Y una vez completada la inyección, regrese el mosquito a la taza.

Acabo de terminar de mostrarles la técnica para inyectar doble cadena de ARN en gti adultos de los ochenta. La eliminación de mosquitos se puede determinar mediante el uso de R-T-P-C-R o R-T-P-C-R cuantitativo. Usaré R-T-P-C-R para determinar la eficiencia de derribo en un punto de tiempo específico de mi g de interés.