Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

El objetivo general de este procedimiento es cultivar biopelículas de pseudomonas aerogen en la superficie apical de células epiteliales vivas de las vías respiratorias humanas. Esto se logra estableciendo primero una monocapa confluente de células epiteliales de las vías respiratorias sobre una superficie de plástico o un cubreobjetos de vidrio. El segundo paso del procedimiento es cultivar constitutivamente un cultivo de bacterias p aerogen, que expresan la proteína verde fluorescente.

El siguiente paso es colocar las bacterias y las células de las vías respiratorias en contacto entre sí, ya sea en un entorno estático o en una cámara de flujo. El paso final del procedimiento es dejar que las biopelículas bacterianas se desarrollen con el tiempo mientras se evalúa la viabilidad de las células de las vías respiratorias. Se pueden obtener resultados que muestran la formación de biopelículas en células vivas de las vías respiratorias a través de microscopía de fluorescencia.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de los pacientes con fibrosis quística, ya que estos modelos de cocultivo pueden utilizarse para desarrollar y validar nuevos regímenes de antibióticos, capaces de erradicar las biopelículas responsables de la colonización crónica de las vías respiratorias. En pacientes con fibrosis quística, el modelo de biopelícula de cocultivo estático utiliza células CFBE, que son vías respiratorias humanas inmortalizadas. Las células epiteliales desarrolladas originalmente a partir de un individuo con fibrosis quística siete a 10 días antes de la inoculación bacteriana siembran las células CFBE en una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos.

Sembramos células a una concentración de dos veces 10 a la quinta célula por pocillo en 0,5 mililitros de medio esencial mínimo o MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino dos milimolares L-glutamina, 50 unidades por mililitro, penicilina y 50 microgramos por mililitro. La estreptomicina hace crecer las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. 95%aire durante siete a 10 días cambiar el medio cada dos o tres días.

Estas condiciones conducirán a la formación de uniones confluentes, monocapa y estrechas un día antes del experimento. Inocular un cultivo de cinco mililitros LB con pierro gen de un caldo congelado y cultivar 18 horas a 37 grados centígrados en un rotador. A 200 RPM utilizamos p aerogen que transporta el plásmido PSMC 21 para la expresión constitutiva de GFP el día de la inoculación bacteriana.

Retire el medio de las células de CFPE y agregue un volumen igual de medio de microscopía, que es MEM sin rojo de fenol, complementado con dos milimolares de confluencia de inocular L-glutamina, monocapas de CFBE con posa a una multiplicidad de infección de aproximadamente 30 a uno en relación con el número de células CFBE originalmente sembradas para una placa de 24 pocillos. Esto equivale a 1,2 por 10 de la séptima UFC por mililitro en 0,5 mililitros de MEM por. Incubar bien la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, 95% de aire durante una hora.

Después de la incubación de una hora, retire el snat y reemplácelo con microscopía nueva. Medio suplementado con arginina al 0,4%. La adición de arginina retrasa la destrucción de la monocapa el tiempo suficiente para que se formen biopelículas en las células de CFPE.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, 95% de aire durante varios puntos de tiempo hasta aproximadamente ocho horas cada dos horas. Analice la integridad de la monocapa de CFBE y el crecimiento de la biopelícula mediante microscopía. El modelo de biopelícula de cocultivo de células de flujo requiere la formación de una monocapa confluente de células CFBE en un cubreobjetos de vidrio de 40 milímetros de diámetro.

Para lograr esto, primero coloque una tapa estéril en un plato de plástico estéril de 60 milímetros de diámetro. A continuación, añada tres mililitros de crecimiento celular precalentado, presionando a medio el cubreobjetos con la punta de la pipeta para eliminar las burbujas atrapadas debajo, y para forzar el cubreobjetos hasta el fondo de la semilla del plato de plástico, dos veces 10 a la sexta célula CFBE por plato. Agite el plato suavemente hacia adelante y hacia atrás, pero evite girar para evitar que las células se centrifugan contra los lados del plato.

Coloque el plato en una incubadora de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire a 37 grados centígrados durante ocho a 10 días. Alimente las células cada dos días con tres mililitros de medio de crecimiento fresco. En estas condiciones, las células formarán una monocapa confluente en el cubreobjetos de vidrio.

El siguiente paso es preparar la cepa bacteriana P aerogen un día antes del experimento. Cultive p aerogen en cinco mililitros de LB durante 18 horas a 37 grados centígrados en un rotador. A 200 RPM, utilizamos la deformación aerogénica P, PO uno, que transporta el plásmido PSM C 21 para la expresión constitutiva de GFP el día del experimento.

A un mililitro de cultivo bacteriano en un tubo de microcentrífuga estéril y centrífuga a 6.000 rpm durante tres minutos. Lave el pellet bacteriano dos veces en un mililitro de microscopía. Diluya 0,5 mililitros de bacterias lavadas y resuspendidas en 4,5 mililitros de medio de microscopía para lograr una concentración de aproximadamente cinco veces 10 de las octavas UFC por mililitro.

Ahora estamos listos para observar las células de CFPE en tiempo real, lo que requiere una cámara de imágenes acoplada a una bomba peristáltica para garantizar un flujo de nutrientes durante largos períodos de tiempo. Y un controlador de temperatura, utilizamos un aparato de celda de flujo de biopelícula estándar. Los biotecnológicos FCS de dos cámaras modificados para acomodar células de CFPE.

Uno de los pasos más críticos en el modelo de biopelícula de cocultivo de celda de flujo es ensamblar la cámara sin dañar el monitor de celda para ensamblar la cámara. Sostenga la mitad superior de la cámara boca abajo para que los tubos de perfusión sean visibles y alinee los orificios de separación de una junta de goma de 0,75 milímetros de grosor en los tubos de perfusión. Apile la corredera de microacueducto provista con la cámara encima de la junta de goma, asegurándose de que el lado ranurado esté hacia arriba.

Luego coloque otra junta de goma en la parte superior de la corredera. El espesor y la geometría interna de esta segunda junta determinarán el volumen de la cámara. A continuación, agregue un mililitro de medio de microscopía precalentado en el centro del portaobjetos.

Coloque la cámara de imágenes sobre una superficie estéril mientras recupera las células de CFPE de la incubadora de cultivos celulares. Retire el medio gastado del plato y lave las células de CFPE una vez con tres mililitros de medio de microscopía precalentado. Usando pinzas lavadas con etanol.

Recupere el cubreobjetos de la placa y bájelo boca abajo sobre el cordón de medio de microscopía colocado en la cámara. El cubreobjetos descansa ahora sobre la segunda junta de goma y la monocapa de células de las vías respiratorias está hacia abajo. Sosteniendo los componentes ensamblados en una mano, coloque la base de la cámara en la parte superior de la pila y gire la cámara rápidamente para que todo esté boca arriba.

Bloquee la base en su lugar girando el anillo. Conecte el tubo de entrada a la bomba de microperfusión de bajo flujo. Una segunda pieza de tubería, conecta la bomba a un medio de microscopía colocado en el baño de agua a 37 grados centígrados.

Situado justo al lado del microscopio. Inicie el flujo a una velocidad de 20 mililitros por hora. Este caudal está dentro de la capacidad de velocidad de natación de posa.

Conecte un tubo estéril precortado de 16 CFL a los tubos de perfusión de entrada y salida de la cámara y luego conecte el controlador de temperatura. Coloque la cámara ensamblada en la platina del microscopio de un microscopio de fluorescencia invertida. Usando una jeringa desechable de un mililitro.

Inyecte la suspensión bacteriana previamente preparada en la cámara utilizando una válvula de dos vías colocada en línea entre la bomba y la cámara para permitir que las bacterias se adhieran a las células de las vías respiratorias. Detenga la bomba durante dos horas. Después de dos horas, el flujo se puede reiniciar y mantener a 20 mililitros por hora.

Durante el resto del experimento, monitoree la integridad de las células de las vías respiratorias mediante interferencia diferencial. Microscopía de contraste durante todo el experimento para comprobar si hay signos de daño en la monocapa. Simultáneamente sigue el desarrollo de biopelículas aerogénicas p marcadas con GFP en la superficie apical de las células de las vías respiratorias.

Al adquirir imágenes con un microscopio de fluorescencia confocal invertida o de campo amplio tanto en los ensayos estáticos como en los de celda de flujo, se encontró que la monocapa de CFPE podía soportar la presencia de p aerogen hasta ocho horas después de la inoculación sin ningún signo de alteración. La integridad de la monocapa epitelial se puede evaluar mediante microscopía de contraste de fase utilizando un invertido, como se muestra en este ejemplo, de una monocapa confluente de células de CFPE cultivadas en placas de cultivo de tejidos. Con el tiempo, el p aerogen producirá toxinas y factores de virulencia que pueden dañar la monocapa de células epiteliales en su totalidad o en secciones.

En este ejemplo de una monocapa de CFPE comprometida, se observa que las bacterias P aerogen, que se muestran en verde, se extienden entre las uniones estrechas de las células epiteliales y acceden a las membranas basolaterales. Por lo general, la formación de biopelículas no se logra en estas condiciones debido al deterioro de la monocapa. Esta imagen muestra una biopelícula aerogénica de p demasiado grande observada 24 horas después de la inoculación después de apoyar con éxito la formación de biopelícula.

La monocapa de CFPE se dañó sin posibilidad de reparación y ahora está prácticamente ausente. Biopelícula residual que crece como una capa plana de bacterias que se adhiere al cubreobjetos de vidrio. Cuando la integridad de la monocapa de la vía aérea no se ve comprometida.

Las biopelículas aerogénicas de P pueden formarse y desarrollarse con éxito en la superficie apical de las células de las vías respiratorias en ambos modelos de cocultivo. Aquí se muestra una imagen representativa de una biopelícula aerogénica A que expresa GFP cultivada en una monocapa confluente de células CFPE utilizando el modelo de biopelícula de cocultivo estático evaluado por microscopía de epifluorescencia. La imagen es una superposición del canal de contraste facial y el canal de fluorescencia.

La siguiente imagen muestra A GFP etiquetado como p aerogen. Biofilm cultivado durante seis horas en una monocapa confluente de células CFBE utilizando el modelo de biofilm de cocultivo de células de flujo para facilitar la visualización de la vía aérea. Los núcleos monocapa se tiñeron con HEXT 3, 33, 42 antes de la inoculación con posa y aparecen de color azul.

Las películas que se presentan como grumos verdes adheridos a la superficie apical de las células de CFPE se dispersan a través de las células de las vías respiratorias. Aquí se muestran las estructuras típicas en forma de hongo de biopelículas aerogenómicas de seis horas de antigüedad que se forman en la monocapa de células A-C-F-P-E después de la reconstrucción en 3D. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cultivar y visualizar con éxito biopelículas bacterianas en una monocapa establecida de células de las vías respiratorias utilizando los modelos de cocultivo descritos aquí, y acoplados a métodos microbiológicos estándar y microscopía de fluorescencia.