La disección de Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster

Hola, mi nombre es Joshua Krupp. Soy investigador posdoctoral en el laboratorio de Joel Levine en la Universidad de Toronto en Mississauga. Este artículo en video demostrará una técnica de disección que desarrollé para el aislamiento de los citos adultos del malpighi del esófago de la tapa de la fruta en moscas de la fruta y otros insectos.

Una capa cerosa compuesta por compuestos de hidrocarburos recubre la superficie externa de la cutícula. Esta capa cerosa proporciona resistencia contra la desecación y protege al animal frente a otros desafíos ambientales. Varios de estos compuestos de hidrocarburos también actúan como señales semioquímicas.

De este modo, median las comunicaciones hormonales e influyen en el comportamiento. Las citas, las células de la glándula, cuya disección se está demostrando, se consideran un sitio primario para la producción de estos compuestos hidrocarbonados particulares. La preparación diseccionada que se muestra aquí permitirá el análisis molecular y genético detallado de las citas de una mosca de la fruta adulta.

Para este procedimiento de disección, se requieren algunas herramientas básicas de disección. Primero, se necesita una pipeta de Pasteur para dispensar medio para insectos frío. En segundo lugar, se requiere un filamento de tungsteno para fabricar una fina aguja de disección; para elaborar esta aguja, el filamento de tungsteno se inserta primero a través de una aguja hipodérmica de pequeño calibre.

Esto proporciona un soporte necesario para el filamento de tungsteno. Luego, el tsin se pasa lentamente a través de una llama. Este procedimiento sirve para quemar parte del tsin en la punta, creando una aguja muy fina y extremadamente afilada.

A continuación, se necesita una placa de disección con almohadilla, ya que la almohadilla está disponible en varios tonos de gris o puede ser transparente. La almohadilla proporciona una superficie blanda para la disección en la que se pueden insertar alfileres de disección. Por último, un juego de pinzas de disección finas número cinco, según sea necesario.

Mantengo a mano un par de pinzas viejas y desafiladas para manipular los alfileres de disección. Esto evita que mi otro juego de pinzas más nuevo se dañe. El siguiente procedimiento prepara el abdomen para la posterior extracción de las cítulas.

El mismo procedimiento puede utilizarse para la preparación de otros tejidos adheridos a la superficie interna de la cutícula. Estos incluyen el corazón y el cuerpo graso. Realizaremos la disección de un macho de tipo silvestre de 60 días de edad.

Las moscas se anestesian primero con CO2 rápidamente. Se retira la mosca hacia la placa de disección. Luego, se sujeta la mosca a la placa de disección.

Colocando una aguja fina de disección a través del tórax, se eliminan las patas y alas de la mosca, al tiempo que se retira el tercer par de patas y se crea una abertura en la cutícula justo anterior al punto donde el tórax se une al abdomen. Luego, el abdomen de la mosca se fija en su lugar insertando una segunda aguja de disección a través del segmento genital. A continuación, se cubre la mosca con un escudo, escudo y una célula de insecto san.

El aire atrapado en el medio se elimina extrayéndolo con una pipeta Pasteur. A continuación, utilizando fórceps, se realiza una incisión a lo largo de la línea media ventral del abdomen. La incisión se extiende desde la abertura y la cutícula creadas al retirar las patas hasta el segmento genital.

Ahora se pueden extraer los intestinos y las gónadas del abdomen. Se cortan ahora la cutícula y la tráquea que conectan el abdomen con el tórax. El único tejido que conecta el abdomen con el tórax es el corazón.

Las esquinas anteriores más externas de la cutícula abdominal ahora están sujetas planas con alfileres. Una vez insertado el primer alfiler, se puede retirar el tórax. Tirando del alfiler superior de la cutícula para dejarla plana, pueden necesitarse ajustes en las esquinas posteriores de la cutícula; es posible que el alfiler en el segmento genital deba reposicionarse para que la cutícula quede completamente plana.

Esto completa la primera parte de la disección. A continuación, demostraré cómo eliminar los citos. La preparación del filete abdominal expone la superficie interna de la cutícula y los tejidos adyacentes.

Estos tejidos incluyen el corazón, el cuerpo graso, el sistema traqueal, la pared corporal, los músculos, la epidermis y los citos. El corazón se encuentra a lo largo de la línea media dorsal del cuerpo graso. El tejido opaco cubre la mayor parte de la superficie cuticular interna traqueal.

Las estructuras tubulares blancas se extienden desde las aberturas esféricas laterales y forman ramificaciones extensas, que infiltran los otros tejidos situados debajo del cuerpo graso. Los citos pigmentados, de color ámbar, irradian desde la línea media hasta el borde lateral de la cutícula en la región posterior de cada segmento; los citos se encuentran directamente debajo de las regiones oscuras y curtidas de la cutícula y pueden ser difíciles de identificar sin un conocimiento previo de su ubicación. En cada segmento abdominal, una hoja prominente de cuerpo graso se sitúa anterior a los citos.

Este tejido del cuerpo graso suele cubrir los citos del segmento que le precede. El vaso dorsal y el cuerpo graso deben eliminarse primero para exponer los citos. El primer paso para diseccionar los citos de adultos consiste en seccionar los troncos traqueales que emergen de las esféricas.

Con la aguja de disección de tungsteno, retire el cuerpo graso y el corazón cortando las conexiones con la superficie interna de la cutícula. Nuevamente utilizando la aguja de disección, coloque la punta de la aguja entre el cuerpo graso y los citos y arrástrela desde el borde lateral de la cutícula hasta la línea media, pasando por debajo del corazón y continuando hasta el lado opuesto, avanzando desde la parte posterior hacia la anterior. Retire el tejido del cuerpo graso y el corazón de la cutícula en cada segmento sucesivo.

Si se realiza con cuidado, las citoes permanecen adheridas a la cutícula y se pueden retirar el cuerpo graso y el corazón. Los músculos completos de la pared corporal sujetan las citoes a la superficie interna de la cutícula. Con la aguja de disección, corte los músculos longitudinales de la pared corporal de cada segmento.

Para ello, arrastre la aguja de disección a lo largo del lado posterior de la hebra de cito, levantando suavemente la hebra desde la superficie de la cutícula. Las hebras de cito, con forma de cinta, deben separarse de la cutícula y pueden colocarse a un lado mientras se eliminan los cito restantes. Es importante tener en cuenta que la pigmentación ámbar de los cito los distingue claramente de los tejidos circundantes.

La intensidad de esta pigmentación aumenta con la edad de la mosca. También vale la pena señalar que una lámina basal y citos de la vaina, este material extracelular proporciona soporte a los grupos celulares y evita que las células se disocien durante la disección. La lámina basal también facilita la eliminación de tejidos adheridos de forma extrínseca al crear un punto débil donde estas adherencias pueden interrumpirse fácilmente.

Una vez retirados de la cutícula y colocados sobre la placa de disección, puede ser necesario eliminar cualquier tejido de cuerpo graso adherido a los citos. Esto se realiza simplemente colocando una aguja de disección entre el tejido del cuerpo graso y los citos, y cortando la conexión al presionar la aguja contra la placa de disección. Reúna los filamentos de citos pinchándolos suavemente con la punta de la aguja de disección.

Una vez adheridas al extremo de la aguja de disección, las citoes pueden deslizarse a través de la superficie del medio de cultivo. Las citoes diseccionadas pueden colocarse directamente en un tampón de lisis celular adecuado para la extracción de ARN o proteínas. Con esto se completa la disección de citoes.

Gracias por ver este artículo en video. Espero que las técnicas de disección demostradas aquí sean útiles para sus estudios. Buena suerte con sus experimentos.