Name: Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: Aprende a preparar cultivos neuronales primarios de embriones de Drosophila en estadio de midgastrula. Este método permite estudiar la excitabilidad eléctrica y la transmisión sináptica en neuronas.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención NS27501 a DKOD. El apoyo adicional para este trabajo a partir de un subsidio del HHMI profesor de DKOD.

I. Drosophila de recogida de embriones <ol><li> Preparar las placas de recolección de huevos <ol><li> Hervir 200 ml dH 2 O con 8 g de agar </li><li> Enfriar a 50 ° C </li><li> Añadir 2 ml de EtOH y 2 ml de ácido acético </li><li> Vierta la mezcla en 35 mm placas petri de plástico, tapas </li><li> Dejar enfriar y guardar en un recipiente hermético a 4 º C </li><li> Hace aproximadamente 80 placas </li></ol></li><li> Preparar pasta de levadura <ol><li> Disolver la levadura para hornear Fleishmans activo en agua para formar una pasta </li><li> Microondas por 20-30 segundos para matar la levadura (cuidado con los hirviendo) </li><li> Tienda en jeringa de 10 cc (sin aguja) a 4 ° C durante 2 semanas </li></ol></li><li> Moscas: Los adultos utilizados para la recolección de huevos son generalmente más productivos entre los 3 y 14 días después de salir, siempre y cuando hayan tenido acceso a los alimentos frescos. Muchas poblaciones de mutantes tienen disminución de la fertilidad que puede manifestarse en una tasa baja de la puesta de huevos y un cambio en la edad en que son más productivos. Por lo general, varios cientos de adultos para hacer una buena puesta de huevos de la población. </li><li> Procedimiento: Aplique una capa delgada de pasta de levadura en una placa de recolección de huevos. Esto proporciona un sustrato favorable para la puesta de huevos. Adultos transferencia vuela a una botella limpia y recolección de huevos de cintas de recogida de la placa en la boca de la botella. No deje que las moscas en estas botellas de más de 3-4 horas cuando la humedad aumenta y las moscas se atascan en pasta y en los lados de la botella. </li></ol> II. Embrión Dechorionation con el blanqueo <ol><li> Establecer un embudo Büchner conectado a un frasco de vacío conectado a un aspirador. Ponga un pedazo de papel Whatman # 1 en el embudo. Con aspiración correr, mojar el papel con agua destilada estéril. </li><li> Enjuague los embriones de las placas de colección en el papel de filtro con un chorro de agua de una botella de lavado. </li><li> Enjuague en varios volúmenes de agua estéril, apague aspirador, y luego agregar un volumen embudo del 50% de cloro. Deje que los huevos se sientan durante 5-10 minutos. El corion se disuelven en 1-2 minutos, pero cuanto más tiempo se deje a los embriones en el blanqueo más contaminante de la levadura será destruido. Escoja cualquier adultos o larvas que se han enjuagado plato. </li><li> Enjuague los embriones en una placa de Petri estéril (no el cultivo de tejidos) con agua destilada estéril. Muchos de los embriones se pegue en el fondo del plato si no ha sido previamente mojado. Enjuagar varias veces con agua estéril en este plato. </li><li> Examinar los embriones con la luz transmitida a escoger a mediados de gástrula embriones etapa. </li></ol> III. Preparación de los cultivos de un solo embrión <ol><li> Hacer DDM1 (ver recetas en la sección IV) </li><li> Vierta el agua fuera de plato de embriones justo antes de cultivo. Cubrir los embriones con medio estéril. </li><li> Establecido 3, 35 mm placas de Petri. Ponga en 4 cubreobjetos redondos autoclave en cada plato. En cada portaobjetos, poner 5 l de medio. Use Bellco cubreobjetos bajo coverlips de vidrio de plomo. Bellco Biológica Cristalería 800-257-7043 Cat # 1943-00012 </li><li> Tire algunas pipetas bastante bien. El pipetas que usamos se tiran en una Narishige PP-83 extractor. Las dimensiones exactas de la pipeta no son esenciales y solemos tirar más fino de lo que quieren y les rompa la punta en el mismo campo de visión que el embrión para medir el tamaño. Usted no quiere a absorber todos los embriones de una sola vez, y tu no quieres la punta tan pequeña que se toma 5 minutos para absorber las células. Objetivo de un punto intermedio. Examinar los embriones con luz transmitida y el uso de un tubo de succión conectado a la boca de la pipeta para retirar el contenido del embrión. Dispersar las células en el portaobjetos preparados con cuidado la expulsión de las células lo más cerca posible del cubreobjetos como sea posible. Es posible que desee examinar el cubreobjetos con mayor potencia y mayor dispersión de las células de la misma manera. </li><li> Permitan que las células se siente por no más de 10 minutos. Inundar el plato con los medios de comunicación y poner en la incubadora, un 4-5% el medio ambiente de CO 2, si se utiliza un medio definido. Temperatura entre 22-24 º C. Nosotros usamos 23 ° C y 95% de humedad. La humedad es importante, ya que quieren evitar la evaporación. Usted puede utilizar un estándar de la incubadora de mamíferos colocado en una cámara frigorífica con el control de temperatura a 23 ° C. </li></ol> IV. DDM1 medio definido para el cultivo de las culturas <ol><li> Hacer DMEM: A 100 ml de F12/DME jamón en los Medios (DMEM) (Irvine Scientific # 9052). <ol><li> Añadir 0,476 g Hepes (20 mM) (Sigma N º H-3375). Mezcla. </li><li> Añadir 1,25 ml de L-glutamina 200 mM (Irvine Scientific # 9317). Mezcla. </li><li> Filtro de campana con jeringa de 0,2 micras filtro de acetato (necesita dos filtros). </li><li> El pH es 6,64 y OSM 288. </li><li> Hacer alícuotas de 10 ml en tubos de centrífuga de 15 ml. </li><li> Almacenar a 4 ° C por no más de 2 semanas. Nota: Siempre use agua esterilizada filtrada y que en los envases que están reservados para los medios de comunicación y suplementos solamente. Nunca coloque un electrodo de pH o una barra de agitación utilizados para otros fines en Media.To hacer DDM1: Añadir suplementos se indican a continuaciónde DMEM justo antes de cultivo. </li></ol></li><li> A 10 ml de DMEM añadir: <ul><li> 100 l de transferrina </li><li> 100 putrescina l </li><li> Selenio 100 l </li><li> La progesterona 100 l </li><li> 50 La insulina l </li></ul></li></ol>

<ol><li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic-AMP-dependent+plasticity+at+excitatory+cholinergic+synapses+in+Drosophila+neurons%3A+Alterations+in+the+memory+mutant+dunce%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cyclic-AMP-dependent plasticity at excitatory cholinergic synapses in Drosophila neurons: Alterations in the memory mutant dunce.</a> J. Neurosci. 20, 2104-2111 (2000).</li>
<li>Hodges, D. D., Lee, D., Boswell, K., Preston, C. F., Hall, L. M., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tipE+regulates+sodium-dependent+repetitive+firing+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">tipE regulates sodium-dependent repetitive firing in Drosophila neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 19, 402-416 (2002).</li>
<li>Lee, D., Su, H., Dowd, O., K, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+receptors+containing+Rdl+subunits+mediate+fast+inhibitory+synaptic+transmission+in+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA receptors containing Rdl subunits mediate fast inhibitory synaptic transmission in Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 23, 4625-4634 (2003).</li>
</ol>

En cultivos de Drosophila preparado a partir de embriones etapa midgastrula las neuronas surgen a partir de precursores neuroblastos, muchos de los cuales se dividen antes de la diferenciación in vitro. Así, este sistema ofrece una oportunidad única para la exploración de los factores genéticos y ambientales importantes en las fases muy tempranas del desarrollo neuronal (Rohrbaugh et al., 2003). Hemos demostrado que las neuronas cultivadas en un medio simple definido diferenciarse en neuronas eléctricamente excitables, que también forma fun...

Los cultivos realizados en este medio de comunicación se debe mantener en un 5% incubadora de CO2 en alrededor de 22-24 º C. Nosotros usamos un estándar de cultivo de tejidos de mamíferos incubadora colocada en una habitación fría y se calienta a 23 ° C. Siempre se usa agua esterilizada filtrada y que en los envases que están reservados para los medios de comunicación y suplementos solamente. Nunca coloque un medidor de pH o una barra de agitación utilizados para otros fines en los medios de comunicación.

preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de drosophila midgastrula etapa

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

Este video muestra el procedimiento para la toma de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Los métodos de recogida de embriones y su dechorionation el uso de cloro se ha demostrado. Con una pipeta de vidrio conectado a un tubo de succión de la boca, que ilustran la eliminación de todas las células de los embriones individuales. El método para la dispersión de las células de cada embyro en una pequeña (5 litros) gota de medio en un portaobjetos de vidrio sin recubrimiento se demuestra. Una vista a través del microscopio menos 1 hora después de la siembra ilustra la densidad celular preferida. La mayoría de las células que sobreviven cuando se cultivan en un medio definido son los neuroblastos que dividen a una o más veces en la cultura antes de extender los procesos de neuríticas por 12-24 horas. Una vista a través del microscopio muestra el nivel de crecimiento de las neuritas y la ramificación se espera en una cultura sana en 2 días in vitro. Los cultivos se envían en un bicarbonato de simple basada medio definido, en un 5% de CO 2 incubadora a 22-24 ° C. Procesos neuríticas siga elaborando durante la primera semana de la cultura y cuando hacen contacto con neuritas de las células vecinas a menudo se forman conexiones sinápticas funcionales. Las neuronas en estas culturas, se manifiestan de voltaje de sodio, calcio, y los canales de potasio y son eléctricamente excitables. Este sistema de cultivo es útil para el estudio molecular de factores genéticos y ambientales que regulan la diferenciación neuronal, la excitabilidad, y la formación de sinapsis / función.

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Puntos de vista de las culturas show en vivo de las células de una hora después de la siembra y las neuronas diferenciadas después de 2 días de crecimiento en un medio de bicarbonato definido. Las neuronas son eléctricamente excitables y forman conexiones sinápticas.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

Este video ilustra el procedimiento para realizar cultivos neuronales primarios a partir de embriones de Drosophila en etapa de gastrulación media. Los métodos para la recolección de embriones...

Me llamo Diana Dowd, y soy profesora en el departamento de Biología del Desarrollo y Células, y Anatomía y Neurobiología en la Universidad de California en Irvine. Hoy voy a demostrar la preparación de cultivos neuronales primarios a partir de embriones de drosófila. Esto implica extraer todas las células de un embrión de drosófila en etapa de gastrulación media y colocarlas en cultivo celular.Y lo que utilizamos estas culturas para es comprender realmente cuáles son los genes y los factores ambientales que son importantes para la regulación de la excitabilidad eléctrica y la transmisión sináptica entre neuronas de drosófila. Para comenzar este procedimiento, debemos recolectar embriones de drosófila. Para ello, tomamos placas de recolección de huevos y esparcimos una pequeña cantidad de pasta de levadura sobre ellas.Es un sustrato favorable para que las moscas adultas pongan sus huevos. Colocamos estas placas sobre frascos que contienen una población de moscas adultas, generalmente de cien a 200 moscas. Luego dejamos que las moscas adultas pongan sus huevos durante aproximadamente dos a tres horas.Luego retiramos las placas de recolección de huevos, y estos son los embriones que u

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Investigación

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Biology

Biología

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía. Puntos de vista de las culturas show en vivo de crecimiento de las neuritas y la imagen de los niveles de calcio con Fura-2.

Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

Ofrecemos un protocolo detallado para la preparación de las células primarias disociada...

Cultivos de células primarias de Drosophila Gástrula embriones

Este video describe un método para cultivar neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón. El proceso incluye el tratamiento del mesencéfalo con una enzima proteolítica, la separación de las células y el cultivo de las mismas en cubreobjetos recubiertos de polímeros en un medio rico en nutrientes con antibióticos para su crecimiento y viabilidad a largo plazo.

Cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral embrionario de ratón

Este video muestra un protocolo para identificar factores exógenos que inician la reactivación de las células madre neurales del cerebro de Drosophila desde su estado de reposo. Las larvas recién eclosionadas se diseccionan para aislar sus cerebros, que luego se cultivan en medios con o sin una hormona de prueba para evaluar el potencial de la hormona para inducir la reactivación y proliferación de células madre neurales.

Análisis de la reactivación de células madre neurales en explantes de cerebro de Drosophila cultivados

El video muestra el proceso de aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón. Los pisos ventrales aislados del mesencéfalo se disocian mediante enzimas. Las neuronas dopaminérgicas resultantes se recolectan y se transfieren a microislas dentro de placas de pocillos múltiples. Las células se incuban con un medio neuronal dopaminérgico para mantener las células a una alta densidad dentro de las microislas.

Aislamiento y cultivo de neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón en el mesencéfalo

Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

Visualización de los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila

Células S2 de Drosophila y neuronas cultivadas son grandes sistemas de obtención de imágenes de orgánulos de transporte con motor in vivo. Aquí se describen los protocolos detallados para el cultivo de ambos tipos de células, su imagen y el análisis de los transportes.

Orgánulos Transporte en Cultivadas Drosophila Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.

Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Se ha establecido un método para reactivar las células madre neurales inactivas en explantes cerebrales de Drosophila cultivados. Usando este método, el papel de las señales sistémicas se puede desacoplar de las señales intrínsecas del tejido en la regulación de la inactividad, entrada y salida de las células madre neurales.

Reactivación de células madre neurales en explantes cerebrales de Drosophila cultivados

Aprende a preparar cultivos neuronales primarios de embriones de Drosophila en estadio de midgastrula. Este método permite estudiar la excitabilidad eléctrica y la transmisión sináptica en neuronas.

Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

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