Preparación de cultivos neuronales a partir de embriones de Drosophila Midgastrula Etapa

Este video muestra la preparación de cultivos primarios de neuronas de midgastrula etapa embriones de Drosophila. Puntos de vista de las culturas show en vivo de las células de una hora después de la siembra y las neuronas diferenciadas después de 2 días de crecimiento en un medio de bicarbonato definido. Las neuronas son eléctricamente excitables y forman conexiones sinápticas.

Mi nombre es Diana Dowd y soy profesora en el departamento de Biología Celular y del Desarrollo y anatomía y neurobiología de la Universidad de California en Irvine. Y hoy voy a demostrar la preparación de cultivos neuronales primarios a partir de embriones de Drosophila. Y lo que esto implica es extraer todas las células de un embrión de Drosophila en fase gastroscópica intermedia y colocarlas en cultivo celular.

Y para lo que usamos estos cultivos es para comprender realmente cuáles son los genes y los factores ambientales que son importantes para la regulación de la excitabilidad eléctrica y la transmisión sináptica entre las neuronas de Drosophila. Para iniciar este procedimiento, tenemos que recolectar embriones de Drosophila. Para ello, cogemos platos de recogida de huevos, untamos un poco de pasta de levadura sobre ellos.

Es un sustrato favorable para que las moscas adultas pongan sus huevos. Colocamos estos platos en botellas que contienen una población de moscas adultas, generalmente de cien a 200 moscas. Y luego dejamos que las moscas, moscas adultas, pongan sus huevos durante unas dos o tres horas.

Luego retiramos las placas de recolección de óvulos, y estos son los embriones que usamos para el procedimiento de cultivo. El siguiente paso en el procedimiento es desenmascarar los embriones, y eso significa que en realidad eliminamos el corion. Lo hacemos lavando los embriones en un embudo Buechner en el que tenemos un trozo de papel de filtro para que atrape los embriones.

Permitimos que se asienten en el embudo de Buchner en una solución de lejía al 50%. Esta solución de lejía al 50% no solo disuelve el corion, sino que también sirve como parte de nuestro procedimiento de esterilización. En realidad, no estamos haciendo este procedimiento en el capó, sino fuera del capó, por lo que los embriones, una vez que se decloran, los lavamos en una placa de Petri.

De hecho, cuando el Corian se ha ido, la membrana del viel es bastante pegajosa y se adherirá muy bien a una placa de Petri. A continuación, puedes verter agua destilada encima de ellos y retirar el agua destilada dos o tres veces y, de hecho, tirar el agua y los embriones se pegarán a la placa de Petri. No utilice un plato de plástico para cultivo de tejidos.

No se apegan a eso. Comenzamos la parte estéril del procedimiento tomando las placas de Petri de los embriones y llevándolas a una campana de flujo laminar. Se trata de cubreobjetos de bellco.

Están sin recubrimiento, pero han sido esterilizados en autoclave y no se han lavado. Encontramos que no funcionan muy bien. Cuando se lavan, generalmente sacamos cuatro cubreobjetos y los colocamos en una sola placa de Petri.

Así que vamos a hacer cuatro cultivos de embriones en cada placa de Petri. Bien, entonces esa placa de Petri está básicamente lista para que comencemos a cultivar, y por lo general hago 12 cultivos, de 12 a 16 cultivos a la vez. ¿Bien? El medio de cultivo que utilizamos es un medio definido relativamente simple.

Es la base A-D-M-E-M, y preparamos este medio líquido una vez cada dos semanas para que se mantenga en buen estado durante dos semanas en el refrigerador. Este ha sido esterilizado. Se ha pasado por un filtro estéril de 0,2 micras y luego añadimos cinco suplementos al medio.

Se preparan una vez cada dos meses y luego se congelan en alícuotas que se agregan a 10 milésimas de pulgada del medio líquido. Así que simplemente eliminamos el contenido. La última, entonces esto es simplemente, simplemente invertimos suavemente este medio para mezclarlo y estamos listos para comenzar. Bien.

Todo está configurado. Tengo mi plato de cultivo que está listo, eso o mi placa de Petri que tiene cuatro tapas listas para usar. Y ahora voy a tomar mi plato con embriones y voy a hacerlo, ahora están sentados en el agua destilada.

Voy a quitar el agua destilada con solo sacudirla. Así es como lo hago directamente en el bote de basura. Y ahora voy a verter alrededor de dos molinos de medios en estos embriones, y ahora están listos para que yo inserte la aguja de vidrio en embriones individuales y elimine el contenido.

Hay que tener a los medios de comunicación en el exterior. Obviamente, si hubiera agua por ahí, tendrías un choque osmótico. Ahora, para prepararme para preparar los cultivos justo antes de retirar el contenido del embrión, pongo la gota de cinco microlitros en los cubreobjetos.

Si lo dejas demasiado tiempo, el pH del medio cambia. Bien, ahora voy a poner una gota de cinco microlitros en el centro de cada uno de los cuatro cubreobjetos. De hecho, es importante que estas gotas se mantengan lo más intactas posible.

Si el medio se esparce por todo el cubreobjetos, luego las celdas se enchapan en algo, es difícil una capa muy delgada de líquido. Lo ideal es que coloquen las células en una bonita gota redonda de líquido. Como puedes ver allí, tenemos cuatro bonitas gotas redondas de líquido listas para usar.

Y ahora tomaré una de las pipetas que saqué y luego la conectaré a este tubo de pipeta de boca. Puede usar cualquier tubo que desee, pero lo bueno de este tubo es que en realidad viene con pipetas de 100 microlitros calibradas para tubos VWR. Y en estos tenemos, hay una pequeña junta de goma aquí.

Puedo insertar la pipeta bucal, me refiero a la pipeta de vidrio en este extremo de la pipeta. Y luego, cuando aspiro el contenido del embrión, no voy a subir más allá de esto, la región donde comienza a estrecharse. Así que hay una gran área que me separa usando la succión del ratón aquí arriba y el lugar donde están las células.

Así que no hay, no hay problema con la contaminación. Si accidentalmente succiona el contenido en esta área, entonces tendrá enormes problemas de contaminación. En nuestras campanas de flujo laminar, tenemos microscopios de disección que son de base scópica.

Esto permite que la luz entre desde debajo del embrión, y esto nos permite ver realmente el surco cefálico y el intestino medio y la imaginación que se verá cuando miremos los embriones reales. Y así es como elegimos realmente la etapa del embrión que es importante para el cultivo para eliminar el contenido del embrión. Usamos pipetas de vidrio, tiramos de un extractor de microelectrodos regular que usamos para hacer nuestras pipetas de registro de parches.

Realmente no nos importa cuáles sean los escenarios. Sacamos pipetas bastante finas porque vamos a romper la pipeta en la placa junto al embrión del tamaño que realmente queramos. A continuación, tomamos estas pipetas de vidrio, las insertamos a través de la membrana viel del embrión y, mediante un tubo de succión bucal que está unido a la parte posterior de la parte posterior de la pipeta.

A continuación, extraemos el contenido de todo el embrión. A continuación, lo movemos todo, sacamos la pipeta y la pasamos a otro plato que tiene un cubreobjetos con una gota de medio de cinco microlitros. Y expulsamos el contenido del embrión en esa gota de cinco microlitros.

Pipeteamos hacia arriba y hacia abajo varias veces para dispersar las células, y luego dejamos que la cubierta se asentara en el plato durante unos 10 minutos antes de inundar el plato con dos molinos de medios. Las placas de células después de haber sido colocadas en una incubadora de CO2 al 5%. Esto es muy importante porque el medio que utilizamos es un medio tamponado con bicarbonato.

Tenemos algunos HEP allí, pero no es suficiente para amortiguar el entorno aéreo. Y por eso hay que utilizar una incubadora de CO2 al 5%. Sin embargo, tiene que estar a una temperatura relativamente baja, alrededor de 22 a 23 grados es lo ideal.

Así que tomamos una incubadora de CO2 estándar que se usaría de cultivos de mamíferos y la calentamos a 37 grados. Lo que hacemos es apagar el calentador, lo tenemos en nuestro laboratorio y podemos poner hielo en el fondo de la incubadora, y eso mantiene la temperatura alrededor de 21 a 25 grados. La otra técnica que utilizamos es tomar, de nuevo, una de estas incubadoras de CO2 de calentamiento estándar y poner la incubadora en una cámara frigorífica.

Luego, puede calentar la incubadora de manera bastante efectiva a 23 grados si la temperatura ambiente es fría a temperatura ambiente. Y esos son los dos métodos que usamos para tener un sello estándar, un sello de mamífero a una incubadora para permitirnos sobrevivir. Muy bien, esta es una Cultura que fue plateada hace una hora con el mismo aumento que vimos justo después de enchapar una hora después del enchapado.

Aquí vemos neuronas que se han diferenciado durante unos dos días. En cultivo, los neuroblastos se han dividido una o más veces y luego han dado lugar a las neuronas, que extienden procesos que forman extensas redes neuróticas superpuestas. Aquí tenemos dos cuerpos celulares que están frente a frente.

El de arriba extiende un proceso a las 11 en punto, y el inferior extiende un proceso a las cinco en punto. Esas son sus principales extensiones. Y luego puedes ver que forman ramas más finas.

Estos se adhieren muy estrechamente al sustrato de vidrio, y hay procesos que se pueden ver que también provienen de otras células que se superponen a estos. Y estos son sitios de posible conexión sináptica. Parchearíamos una de estas células, y en general, con este nivel de elaboración del proceso, tendrían corrientes sinápticas funcionales sinápticas.

Ahora nuestras células crecen en cultivo 12 horas después de la siembra. Habrán extendido procesos bastante agradables. Nuestra fisiología estándar, comenzamos a hacer alrededor de uno o dos después del cultivo.

Y se puede ver que en realidad continúan creciendo los procesos durante los próximos cuatro o cinco días. Y hemos grabado desde células hasta dos semanas en cultivo, pero la mayoría de nuestras grabaciones son entre dos y seis días en cultivo con estos cultivos, entonces que acabamos de preparar a partir de embriones de Drosophila en etapa gastronómica media, tenemos redes de neuronas que se comunican en cultivo. De hecho, podemos observar las propiedades de disparo de estas células.

Tienen diversas propiedades de cocción. Tienen, se disparan de forma repetitiva, algunas células se disparan de forma repetitiva, otras células se disparan al nacer, y estas células son principalmente colinérgicas o GABAérgicas. Y podemos observar las corrientes sinápticas que están mediadas por estos, por los receptores nicotínicos, Aach, H y GABA.