Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

El objetivo de este procedimiento es expresar receptores de células T específicos de antígeno funcional en células T de ratón. En primer lugar, transfectar una línea celular productora de retrovirus con plásmido que contenga el gen TCR de interés para empaquetar el retrovirus que expresa TCR. A continuación, aísle y purifique las células T de los bazos de ratón e infecte estas células T purificadas con el retrovirus producido en el primer paso.

Finalmente, expandir las células T transducidas para expresar y obtener niveles apreciables de receptor. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la expresión de TCRs específicos de antígenos funcionales en células T de ratón a través de citometría de flujo. Hola, mi nombre es Michelle Crow Guard.

Estoy en el Instituto del Cáncer de la Universidad de Nueva York en la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York. Hoy les vamos a mostrar cómo transducir células T primarias, las personas que les mostrarán cómo hacer esto serán Shiong, un postdoctorado en el laboratorio, Kaleena Melek, una estudiante graduada en el laboratorio, y Arian Pérez García, un postdoctorado en el laboratorio. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente como los ratones transgénicos es que requiere mucho menos tiempo.

Este método puede ayudar a responder preguntas inmunológicas clave, como qué TCR puede dar una mejor respuesta contra los antígenos. Esta técnica se puede aplicar para la terapia adoptiva de transferencia de células T, que ha demostrado ser prometedora para el tratamiento de pacientes con cáncer y consiste en la modificación in vitro de las células T humanas para garantizar la expresión equitativa de las cadenas alfa y beta del receptor de células T. Subclonar el gen de interés en el mismo vector retroviral bajo el control del mismo promotor.

Prepare ADN plasmático de alta calidad con el kit de preparación Kyogen Maxi y haga un stock de un microgramo por microlitro. Retire los medios de la placa con celdas de empaquetado retroviral de platino E y lave la placa una vez con un XPBS. Desalojar las células añadiendo tripsina EDTA e incubar a 37 grados centígrados durante unos minutos.

Neutralice las células desplazadas con medios DMEM y transfiéralas a un tubo de halcón. A continuación, centrifugar las células a 1000 veces G durante cinco minutos. Aspire el supinato y vuelva a suspender el pellet de células en el medio DMEM.

Determine el número de células y diluya las células a 0,6 veces 10 a seis por mililitro en placa. 10 mililitros de suspensión celular en una placa de cultivo de tejidos recubierta de polilisina de 10 milímetros y crecimiento durante la noche en una incubadora celular a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5%. A la mañana siguiente, examine las células bajo un microscopio óptico para verificar aproximadamente el 80% de fluidez.

Retire con cuidado el medio de la placa. Lave las células una vez con un XPBS y agregue 10 mililitros de medios DMEM frescos precalentados sin penicilina ni estreptomicina. Para el complejo de transfección de labios medios, prepare dos mezclas y opti ME M1 de ADN y el otro de reactivo de lipectomía se equilibren por separado durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego mezcle suavemente e incube durante 20 minutos. A temperatura ambiente, gotee lentamente la mezcla en las células E de platino. Mueva suavemente el plato hacia adelante y hacia atrás para distribuir la mezcla de transfección de manera uniforme.

A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora de células. Después de seis a ocho horas, reemplace el medio con 10 mililitros de medio DMEM fresco para la producción viral. Extraiga el bazo de un ratón y transfiéralo al medio RPMI.

Coloque el bazo en un colador de celdas. Machaca el bazo con un émbolo de jeringa en una placa de cultivo de tejidos de cinco centímetros. Enjuague las células del filtro de células con PBS estéril para cosechar las células centrífugas a 1000 veces G durante cinco minutos.

Deseche el suponante. Continúe con Resus suspendiendo el pellet de la célula en un tampón de lisado CK. Añadiendo dos mililitros por bazo, incubar durante dos minutos.

A temperatura ambiente. Agregue medio RPMI hasta 20 mililitros y centrifugue a 1000 veces G durante cinco minutos. Finalmente, vuelva a suspender el pellet de célula en PBS estéril.

Determine el número de celdas y centrifugue a 1000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Con el fin de activar las células T de ratón antes de la transducción viral, recubren las placas con anticuerpos activadores, a saber, anti CD tres épsilon y anti CD 28. Prepare una mezcla de anticuerpos de un microgramo por mililitro de anti CD, tres épsilon y dos microgramos por mililitro de anti CD 28 en PBS estéril, dispense 250 microlitros de la mezcla de anticuerpos en cada pocillo de la placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos e incube durante dos horas a 37 grados centígrados.

Etiquete magnéticamente las células del bazo de acuerdo con el manual del producto. Coloque una columna LS en el campo magnético. Aplique la suspensión de celda etiquetada en la columna.

Recoja el flujo a través de CD ocho de ratón enriquecido más células T. Lavar la columna tres veces con tres mililitros de tampón y combinarla con el soplado anterior. Tiñir las células con anticuerpos anti CD tres épsilon y anti CD ocho alfa y analizar la citometría de flujo.

A continuación, centrifugar las células a 1000 veces G durante cinco minutos y resuspender la célula a 1 millón de células por mililitro en medio RPMI con IL humana recombinante dos. Retire la solución de anticuerpos de la placa de activación. Enjuague cada pozo con PBS estéril.

Agregue un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo y coloque la placa a 37 grados centígrados. 5%de dióxido de carbono en una incubadora de celdas. Después de dos días de producción del virus, el medio en la placa de células ESE de platino debería volverse amarillo.

Transfiera el supinato viral a un tubo cónico de 15 mililitros para eliminar los restos celulares. Centrifugar el sobrenadante del virus S a 1000 veces G durante cinco minutos. Transfiera con cuidado el virus supinato a un tubo nuevo.

Deje un poco de líquido en el fondo del tubo y no moleste los restos de las células. Recoja las células T activadas de la placa en un tubo cónico de 50 milímetros. Determine el número de celda.

Guarde algunas células en un tubo separado para usarlas como centrífuga de control negativo a 1000 veces G durante cinco minutos y deseche el nadante supino. A continuación, vuelva a suspender el pellet de células en decúbito supino del virus. Natante a 10 a las seis células por mililitro con 20 nanogramos por mililitro de humano recombinante, interleucina dos y 10 microgramos por mililitro de sulfato proteico.

Agregue un mililitro de suspensión de celda a cada pocillo de la placa de 24 pocillos para el tubo de control. Resus. Suspenda las células en medio RPMI a la misma densidad celular con la misma cantidad de humano recombinante, interleucina dos y sulfato de proteína. Agregue las celdas al mismo plato.

Envuelva la placa con una centrífuga de película plástica durante 90 minutos a 2000 veces G a 32 grados Celsius sin interrupción. Después de la centrifugación, retire la película de plástico. Agregue un mililitro de medio RPMI fresco con 20 nanogramos por mililitro de interleucina humana recombinante, dos a cada uno, bien vuelva a colocar la placa en la incubadora.

Es importante examinar diariamente las células T transducidas. Divida las celdas en proporciones de una a tres cuando sea necesario. No dejes que las células crezcan demasiado o que el medio se vuelva amarillo al sexto o séptimo día.

Teñir las células con anticuerpo y tetrámero MHC específicos para el TCR para evaluar la expresión de TCR en la superficie de las células T. Utilice las células T UNSD como control. Estas células T transducidas ya están listas para otras aplicaciones posteriores.

Antes de la transducción viral. Es ventajoso obtener subconjuntos de células T de alta pureza utilizando perlas magnéticas comerciales para evaluar el nivel de expresión de TCR en células T. Se pueden utilizar anticuerpos específicos para las cadenas TCR alfa o beta.

Típicamente, entre el 30% y el 80% de las células pueden expresar TCR transducido dependiendo de los genes TCR y los títulos del virus. El tetrámero MHC específico para el TCR también se puede utilizar para verificar aún más la expresión funcional de los TCR. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en condiciones saludables después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de citotoxicidad, ácido o liberación de citocinas, para responder a preguntas adicionales como la especificidad y la sensibilidad del transductor. Los TCRs.

Después de ver este video, debería ser un experto en la transducción de su TCR favorito en células T primarias. Así que nos vemos en el laboratorio.