Expansión ex vivo de células T tumor-reactiva por medio de la 1/Ionomycin briostatina y la formulación de la cadena gamma común de citoquinas

Los objetivos de este experimento son inducir la activación de las células T por la micina de un ion con estatinas de Brios, así como la diferenciación de las células T por citocinas de cadena gamma que comienzan con el aislamiento de células T sensibilizadas por tumores del bazo y los ganglios linfáticos. A continuación, actívelo con brios estatina uno y micina ion dos miméticos de señales intracelulares que aumentan la actividad de la proteína quinasa C y el calcio intracelular respectivamente. Cultivo en presencia de IL siete IL 15 y IL dos para la diferenciación y expansión de linfocitos T reactivos tumorales.

La poderosa combinación de los resultados del interferón gamma EISA y el ensayo de citotoxicidad del hecho puede arrojar luz sobre la reactividad tumoral de las células T expandidas y ofrecer información potencial para la inmunoterapia adoptiva. Este método de expansión exvivo de las células T reactivas a los tumores puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología tumoral, como cuál es la función de las citocinas comunes de las imágenes gamma en la diferenciación de las células T reactivas a los tumores. ¿Y cuál es el papel de cada fenotipo de células T, como las células efectoras, las células de memoria efectoras y las células de memoria central, en la generación de una respuesta de memoria a largo plazo contra el cáncer?

El aislamiento de los ganglios linfáticos y el bazo y el manejo séptico de los linfocitos son procedimientos difíciles de implementar, pero se pueden aprender rápidamente. Por observación. Los ratones hembra transgénicos FVBN 2 0 2 expresan un nuevo transgén inactivado de rata bajo la regulación del promotor MMTV y, como resultado, desarrollaron carcinoma mamario espontáneo entre los cuatro y los 10 meses de edad.

En este protocolo, estos ratones portadores de tumores espontáneos se utilizan como donantes de células T reactivas al tumor. Para empezar, aislar los ganglios linfáticos y el bazo que drenan el tumor de ratones transgénicos portadores de FVBN 2 0 2. Ahora prepare una suspensión unicelular en hielo RPMI 1640 suplementado con un cultivo de 10%FB sce A a 10 a las seis células por mililitro en medio completo que contiene 15%FBS con un micromolar cin cinco nano molar brios estatina uno y 80 unidades por mililitro.

IL dos durante 16 horas con nuestro medio PMI equilibrado a 37 grados centígrados, lavar las células tres veces, luego cultivar a 10 a las seis células por mililitro en medio completo con 10 nanogramos por mililitro, cada uno de IL siete e IL 15 durante 24 horas. Con el fin de activar aún más las células, pulso con una adición de 40 unidades por mililitro IL dos durante 24 horas. Ahora divida las células y cultívelas con 10 nanogramos por mililitro, cada una de IL siete y IL 15 durante cuatro días más si es necesario, cambie el medio y divida las células cada dos días.

Recoja las células T primarias expandidas por centrifugación, enumere las células mediante microscopía óptica y calcule la expansión del pliegue de las células T. Ahora prepare las células para la citometría de flujo para determinar la proporción de células T CD ocho positivas y CD cuatro positivas. En primer lugar, bloquee la unión inespecífica de anticuerpos a los receptores FC mediante la incubación de las células con el anticuerpo anti CD 16, CD 32 durante 20 minutos en hielo.

A continuación, lavar las células dos veces con dos mililitros de PBS helado suplementado con azida de sodio al 1% y teñir las células incubándolas con anticuerpos Fitz CD cuatro y PE CD ocho durante 20 minutos en hielo. Lavar dos veces con dos mililitros de PBS helado suplementado con 1% de FBS y 0,1% de azida de sodio. Por último, fije las células con aldehído paraforme al 1% y analice las muestras en un Beckman Coulter FC 500 utilizando el software summit versión 4.3 en placas de cultivo de seis pocillos, pipeteando células T con células tumorales mamarias en una proporción de efector a objetivo de 10 a uno y tres mililitros por pocillo.

Medio completo que contiene 20 unidades por mililitro de IL, dos incuban a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Realice la tinción de anticuerpos de tres colores para nuevos, seguidos de PE anti-US IgG y Xin five fite y propidium yoduro de acuerdo con los datos de la puerta del protocolo del fabricante en nuevas células tumorales positivas y analice la viabilidad de las células tumorales con una Xin cinco pi. Una activación de las células T con BI durante 16 horas da como resultado la muerte de las células T vírgenes que no están sensibilizadas con el tumor in vivo.

Después de la bi selectividad de las células T reactivas al tumor, se expanden hasta 2,8 veces en un cultivo de seis días con las citocinas de la cadena gamma, tanto las células T CD ocho positivas como las células T CD cuatro positivas se expanden por igual con las citocinas de la cadena gamma. Después de un cultivo ex vivo de seis días, las células T expandidas ex vivo muestran una alta capacidad de respuesta frente a los tumores a los que se sensibilizaron los ratones donantes, según lo evaluado por la producción de interferón gamma. En presencia de nuevos carcinoma mamario de ratón o células tumorales MMC positivas, las células T expandidas ex vivo pueden inducir la apoptosis en las nuevas células tumorales MMC positivas, de modo que la viabilidad de las células tumorales disminuye del 92% al 61% en 48 horas.

Al intentar este procedimiento, debe recordar trabajar en condiciones asépticas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seleccionar y expandir las células T activas para la terapia adaptativa de células T de los cánceres.