Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

Cargue una suspensión de células de mamíferos en las cámaras del respirómetro que contienen medios y séllelas con tapones para crear un sistema cerrado para la medición de oxígeno.

Un sensor dentro de cada cámara mide el flujo de oxígeno en tiempo real, la tasa de consumo de oxígeno celular.

Inyecte digitonina a través de los tapones para permeabilizar las membranas celulares, permitiendo que los componentes citosólicos se difundan.

Esto reduce la disponibilidad de sustrato para la cadena de transporte de electrones mitocondriales, disminuyendo el flujo de oxígeno.

Introducir piruvato y malato, que ingresan a las mitocondrias y generan portadores de electrones.

Estos portadores donan electrones a los Complejos I y II del ETC, iniciando la transferencia de electrones y aumentando el flujo de oxígeno.

Inyecte ADP para iniciar la síntesis de ATP, lo que eleva aún más el flujo de oxígeno.

A continuación, titule un desacoplador paso a paso para interrumpir el gradiente de protones, maximizando el flujo de oxígeno.

Finalmente, inyecte antimicina A para inhibir el Complejo III, deteniendo el transporte de electrones y minimizando el flujo de oxígeno.

Este perfil de flujo revela la respiración mitocondrial en las células permeabilizadas.

Para comenzar, agregue el medio de respiración mitocondrial MiR05 en la cámara limpia de Oroboros. Inserte el tapón para cerrar la cámara y sifone el exceso de medio del receptáculo del tapón utilizando el sistema de succión.

Antes de agregar las células HEK 293T, calcule el volumen de suspensión de células necesarias para lograr una concentración experimental de 1 millón de células por mililitro.

Luego, retire el tapón de la cámara y colóquelo en la rejilla. Con una pipeta, retire un volumen de MiR05 Vout de la cámara correspondiente al volumen calculado de la suspensión de la celda.

Después de volver a suspender completamente la suspensión de células con una pipeta, agregue el volumen calculado a la cámara.

Para cerrar la cámara, inserte el tapón, asegurándose de que no queden burbujas atrapadas en el interior. Extrae cualquier exceso de líquido del receptáculo del tapón con el sistema de succión.

Espere a que se estabilice el flujo de oxígeno, lo que generalmente demora unos 15 minutos.

Las trazas del flujo de oxígeno se muestran en el panel superior de ambas cámaras, mientras que la concentración de oxígeno se muestra en el panel inferior.

Para preparar las microjeringas, seleccione y limpie la adecuada según el tipo de producto químico y el volumen a valorar. Coloque la microjeringa en la rejilla de la jeringa.

Ahora, cargue la jeringa con el producto químico de acuerdo con el protocolo de titulación de sustrato-desacoplador-inhibidor respiratorio o protocolo SUIT, evitando burbujas de gas. Llene la jeringa con al menos 1 microlitro más del volumen requerido.

Presione el émbolo hasta alcanzar la marca deseada en el cilindro de vidrio, asegurándose de que aparezca una pequeña gota en la punta de la aguja. Limpie la gota en la pared del vial químico antes de continuar con la valoración.

Al realizar la valoración, la aguja debe insertarse completamente a través del capilar del tapón hasta que la terminación del cilindro de vidrio esté en contacto con el tapón, y el producto químico debe inyectarse rápidamente en la cámara.

Para iniciar este protocolo SUIT en particular, agregue digitonina a una concentración experimental de 5 microgramos por mililitro en ambas cámaras. Luego, haga clic en Aceptar en la ventana del evento para configurar el evento correspondiente para ambas cámaras.

Extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón. Espere a que se estabilice el flujo de oxígeno y registre durante al menos 2 minutos.

Valore el piruvato en ambas cámaras seguido de malato para alcanzar las concentraciones experimentales respectivas. Haga clic en Aceptar en la ventana del evento.

Ahora, extrae el exceso de líquido del receptáculo del tapón, espera a que se estabilice el fundente y graba durante unos 2 minutos.

A continuación, agregue ADP a una concentración experimental de 2,5 milimolares y haga clic en Aceptar en la ventana del evento.

Después de eliminar el exceso de líquido, espere a que se estabilice el fundente. El fundente puede tardar hasta 20 minutos en estabilizarse.

Luego, repita el proceso con CCCP en incrementos de 0.5 micromolares para alcanzar el flujo máximo.

Agregue antimicina A para alcanzar una concentración experimental de 2,5 micromolares.

Después de alcanzar la estabilización del flujo, haga clic en el botón Detener medición.

Para el análisis de datos, cambie el diseño de superposición a cámaras separadas. Establezca marcas en secciones estables y representativas del gráfico de flujo, evitando artefactos de valoración.

Selecciona Marcas en el menú superior y, a continuación, selecciona Marcar estadísticas. Seleccione la mediana en el menú desplegable "modo de estadísticas" y haga clic en Copiar al portapapeles para transferir los datos para su posterior análisis.