Preparación y Cultura de rebanadas de pollo tronco cerebral auditivo

El objetivo general de este procedimiento es preparar pollo, rodajas auditivas de tronco encefálico para ser utilizadas para la fisiología de células enteras in vitro o cultivos organotípicos a largo plazo. Esto se logra primero extrayendo el embrión del óvulo. El segundo paso del procedimiento es diseccionar el cerebro del cráneo y aislar la región auditiva del tronco encefálico.

El tercer paso del procedimiento es preparar rodajas de la región del tronco encefálico en un viome. El paso final del procedimiento es colocar rodajas de tronco encefálico en una cámara para registros fisiológicos, o en placas Millipore para su cultivo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cortes de tronco encefálico auditivos saludables de embriones de pollo a través de registros fisiológicos o cultivos organotípicos a largo plazo.

Hola, mi nombre es Armand Sidle. Ambos métodos pueden proporcionar información sobre el desarrollo auditivo de las aves. También se puede utilizar para estudiar la regeneración topográfica de exones, la dinámica de las dendritas, así como las propiedades intrínsecas y sinápticas debido a la estructura y función únicas de este circuito auditivo binaural.

Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades. El tejido necesita ser rápidamente diseccionado, cortado y almacenado con el fin de tener muestras viables para enfoques fisiológicos y de cultivo. Primero, haga una solución de agar al 4% agregando 40 miligramos de agar por mililitro de agua destilada y caliente en el microondas hasta que hierva.

Vierta la solución de agar caliente en una placa de Petri y déjela enfriar hasta que esté firme una vez solidificada. Corta un pequeño bloque de agar y pégalo a la etapa de vibrato. A continuación, prepare de 500 a 1000 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial o un líquido cefalorraquídeo para más tarde.

Úselo en la cámara de la etapa de vibrato burbujeando continuamente con una mezcla de 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono en un rango de pH, 7.2 a 7.4 y una osmolaridad de 295 a 310 mili osmoles por litro. Mientras el LCR A burbujea, limpie la disección en áreas de cultivo, Vibram y cuchilla con etanol al 70%. Enjuague la hoja de vibram con agua destilada y déjela secar, coloque una almohadilla de absorción de líquido limpia en el área de disección y coloque las herramientas de disección adecuadas, que generalmente consisten en un bisturí, tijeras, pinzas, hojas de afeitar, alfileres, placa de Petri y una espátula debajo de una campana de cultivo de tejidos estéril

Plato de pocillo con un mililitro de cultivo, medio e incubar a 35 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Prepare tantos insertos de membrana de cultivo como sea necesario y guárdelos en la campana para más tarde. Úselo en la almohadilla de disección.

Coloque un óvulo debajo de una fuente de luz para ubicar el espacio lleno de aire vacío del embrión, que generalmente es el lado grande del huevo. Rompe el lado grande del huevo con el extremo plano de la espátula, exponiendo el saco de membrana. Haz un corte en el saco de la membrana con el bisturí o las tijeras, y extrae suavemente la cabeza del embrión de pollo con la espátula.

Con unas tijeras. Decapita rápidamente la cabeza del embrión. Coloque la punta de una hoja de afeitar ligeramente posterior a la mitad de los ojos y haga una incisión rostral para mimar la línea media a través del cráneo.

Aplicar una presión suave para los embriones más jóvenes. Use menos presión para los embriones más viejos. Use más ahora que se ha hecho la incisión.

Empuje suavemente a un lado la piel y las plumas para que los animales mayores expongan el cráneo y verifiquen la línea media. Cortar. Con una fuerte presión, bloquee la porción rostral del cráneo cortando con una cuchilla de afeitar. Coloque la hoja detrás de los ojos y corte rápidamente a través de todo el cráneo y el tejido cerebral.

Coloque el tejido bloqueado en una placa de Petri con el lado del mimo hacia arriba. Sujete el tejido a través de la región muscular lateral y sumérjalo completamente con burbujas. Un líquido cefalorraquídeo.

Hacer incisiones desde la línea media hasta los laterales con pequeñas tijeras en la región caudal del cráneo, ligeramente anteriores a los músculos visibles del cuello a ambos lados de la cabeza. Separar el cráneo y el tejido para exponer el cerebelo y el cerebro. Ahora que el tejido encefálico está expuesto, localice el cerebelo y el tronco encefálico para extraer el tejido del cráneo.

Use un par de tijeras pequeñas para cortar suavemente de la base del cráneo el tejido adherido que rodea el tronco encefálico en el lado ventral. Una vez que se haya extraído el tronco encefálico del cráneo, sujételo a una placa de Petri llena de cigarro a través de la óptica. A continuación, retira por completo el cerebelo cortando los pedúnculos con unas tijeras pequeñas, dejando al descubierto el suelo del cuarto ventrículo.

Use pinzas para quitar cualquier membrana de tejido y vasos sanguíneos de la superficie del tronco encefálico y haga cortes laterales a través del teta óptico. Para liberar el tronco encefálico, coloque una pequeña cantidad de superpegamento en la etapa Vibram frente al bloque de agar con pinzas en ángulo suave pero rápidamente. Levante el tronco encefálico a la altura de la médula espinal y coloque el tejido sobre el superpegamento con el lado rostral hacia abajo y el lado dorsal hacia la cuchilla de vibram.

Retira el exceso de pegamento con un pañuelo de papel o papel de filtro. Llene suavemente la etapa vibram con aproximadamente 100 mililitros de LCR A oxigenado. Si el corte se realiza rápidamente, está bien usar el LCR A oxigenado preparado.

De la primera sección. Coloque la cuchilla de vibram de modo que quede en un ángulo de 20 a 22 grados con respecto a la etapa de vibram. Inicie el vibram a la amplitud máxima de oscilación.

A continuación, mueva la platina hacia arriba de la cuchilla de modo que la parte superior del tejido quede paralela a la cuchilla. Antes de cortar. Mueva rápidamente la cuchilla hacia el tejido del tronco encefálico, pero disminuya la velocidad considerablemente justo antes de que la cuchilla entre en contacto con el tejido.

Ahora que la cuchilla está en posición, comience a cortar el tejido con el movimiento de avance más lento posible. Una vez que atravieses toda la sección coronal del tejido, aleje suavemente las rodajas de la hoja con un pincel y deséchelas. Baje la etapa de vibrato en pasos de 300 a 500 micrómetros y corte.

Nuevamente, repita hasta que las firmas anatómicas sean visibles en el tejido del tronco encefálico, descartando todos los cortes anteriores. Ahora corte y recoja tejido del tronco encefálico que contiene estructuras auditivas entre 200 y 1000. Espesores micrométricos que recogen cuidadosamente las lonchas utilizables en el orden de corte.

Si las rodajas se van a utilizar para la fisiología in vitro, que se mostrará en una sección posterior de este video, en este punto deben almacenarse individualmente en cámaras personalizadas hechas de tubos de plástico huecos abiertos en la parte superior y malla de nailon pegada en la parte inferior. Cada cámara individual está conectada a una cámara de almacenamiento más grande en la que se burbujean continuamente aproximadamente 350 mililitros de LCR A. Si se van a utilizar rodajas para cultivos típicos orgánicos, consulte la siguiente sección inmediatamente después de la recolección de rebanadas. Transfiera rodajas con aproximadamente 500 mililitros de LCR A utilizando una pipeta de vidrio pulido al fuego equipada en un extremo con una pera de goma a una placa de 48 pocillos sobre hielo.

Colocando una rebanada por pocillo y manteniendo el orden de corte. Cuando termine, recoja todos los trozos de un cerebro, lleve la placa de 48 pocillos a la campana de cultivo de tejidos. Recupere la placa de seis pocillos que se preparó anteriormente de la incubadora y llévela también a la campana.

Coloque un inserto de membrana en un pocillo con medio de cultivo, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo. Con una pipeta de vidrio, transfiera una rebanada en una gota de LCR A sobre la membrana húmeda. Inserte y retire cualquier exceso de líquido cefalorraquídeo A que aún esté en la parte superior con una micropipeta.

Repita para un máximo de cuatro rodajas por membrana y coloque las rodajas de manera que no se toquen entre sí ni con el borde de la membrana. Almacene los cultivos en una incubadora a 35 grados centígrados y manténgalos cambiando el medio de cultivo tres veces por semana bajo una cubierta de cultivo de tejidos. Coloque cada rebanada en una cámara de retención individual utilizando una pipeta de vidrio pulido al fuego equipada en un extremo con la pera de goma.

Continuando manteniendo el orden de corte. La cámara de retención debe llenarse con el líquido cefalorraquídeo A preparado anteriormente y burbujear continuamente con una mezcla de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono todo el tiempo durante los experimentos de fisiología. Deje que las rodajas se equilibren colocando la cámara de retención en un baño de agua a 35 grados centígrados durante aproximadamente una hora, y luego déjela reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Las rodajas se pueden usar hasta seis horas después de retirarlas del baño tibio. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, las rodajas se pueden transferir de la cámara de retención a una cámara de registro de 0,5 mililitros montada en un microscopio para experimentos electrofisiológicos. Aquí se muestra un esquema representativo e imágenes in vitro del circuito auditivo de pollos.

Las imágenes de corte son típicas de la región auditiva del tronco encefálico y, con la práctica, se pueden identificar fácilmente. Las entradas excitatorias de ORL desde el nervio auditivo o un proyecto N tanto al núcleo Magno cellis o NM como al núcleo angularis o N na. La NM proyecta entradas excitadoras bilaterales al núcleo, laminas o NL en ambos lados del tronco encefálico.

Una entrada inhibitoria del núcleo olivar superior o SON se proyecta a los na, nm y nl. Aquí, se muestra un corte coronal del tronco encefálico auditivo de un pollo E 11 después de siete días. En la cultura.

Las neuronas se marcaron utilizando métodos inmunohistoquímicos, un anticuerpo contra la proteína dos asociada a los microtúbulos, que se encuentra en el soma y las dendritas, marca las neuronas en verde. Un grupo de neuronas y axones NM se marca en rojo a través de la electroporación de un tinte de rina. Los terminales axónicos nm ipsilaterales indicados por las puntas de flecha blancas se pueden ver proyectándose hacia las dendritas NL dorsales.

Aquí se muestran cambios de voltaje de membrana superpuestos en respuesta a pasos de corriente hiperpolarizante y despolarizante de tejido agudo y cultivado a cuatro y siete días en cultivo. Obsérvese los cambios en el hundimiento de voltaje hiperpolarizante, la fuerte reducción en la corriente de salida y el disparo de potencial de acción única que se desarrolla de manera similar en el enfoque de cultivo de cortes. En comparación con los potenciales de membrana en reposo de los tejidos agudos equivalentes a la edad, estaban entre menos 55 y menos 60 milivoltios. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 15 minutos si se hace correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar técnicas estériles adecuadas, y después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar rodajas de tallo de trenza auditiva de pollo para usar para registros fisiológicos o para cultivar.