Ensayo de ramificación de glucógeno para medir el grado de ramificación de glucógeno

Los polisacáridos ramificados, como el glucógeno, comprenden residuos de glucosa unidos linealmente a través de enlaces alfa-1,4-glucosídicos y en ramas a través de enlaces alfa-1,6-glucosídicos.

Para determinar el grado de ramificación en los polisacáridos, comience con un reactivo colorante acuoso que contenga yoduro de potasio, yodo y cloruro de calcio. En condiciones acuosas, el yoduro de potasio y el yodo producen iones de yoduro.

En tubos de microcentrífuga separados, mezcle el reactivo con polisacáridos de estructuras de ramas conocidas y una muestra de glucógeno con una estructura no caracterizada.

Los polisacáridos adoptan estructuras helicoidales a través de sus enlaces alfa-1,4-glucosídicos. Los iones de yoduro se unen a este núcleo helicoidal, formando cadenas lineales de poliyoduro. Esto da como resultado la formación de complejos de transferencia de carga entre los polisacáridos y las cadenas de poliyoduro, lo que da como resultado complejos de polisacárido-yoduro coloreados.

Los polisacáridos no ramificados con cadenas de poliyoduro más largas desarrollan un color azul, mientras que los polisacáridos ramificados con cadenas de poliyoduro más cortas desarrollan complejos amarillentos a marrón anaranjado. El cloruro de calcio en el reactivo intensifica el color complejo.

Transfiera la mezcla a cubetas desechables. Usando un espectrofotómetro, mida el espectro de absorbancia de 330 a 800 nanómetros.

Los complejos no ramificados con un color azul absorben la luz en longitudes de onda más largas, lo que demuestra un desplazamiento hacia la derecha en los máximos de absorbancia. Por el contrario, los complejos ramificados absorben la luz en longitudes de onda más cortas, y el desplazamiento hacia la izquierda en los máximos de absorbancia indica una mayor ramificación en la estructura.

Los máximos de absorbancia de la muestra de glucógeno no caracterizada a aproximadamente 450 nanómetros confirman su estructura ramificada.

Para determinar la ramificación del glucógeno, combine 650 microlitros de material de reactivo de color de yodo/cloruro de calcio con 100 microlitros de agua en un tubo de 1,5 mililitros y mezcle bien la solución antes de transferirla a una cubeta de metacrilato desechable. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro para realizar una ejecución en un modo de escaneo de longitud de onda para recopilar el espectro de fondo de 330 a 800 nanómetros.

En un tubo separado de 1,5 mililitros, combine 650 microlitros del reactivo de color de yodo / cloruro de calcio de trabajo con 50 microgramos de glucógeno de ostra y complete el volumen final a 750 microlitros con agua. Después de mezclar bien la mezcla, transfiera la solución a una cubeta de metacrilato desechable para recolectar un espectro de absorción de 330 a 800 nanómetros.

Del mismo modo, obtenga un espectro de absorción con 50 microgramos de amilopectina y 30 microgramos de amilosa como se describió anteriormente.

Para obtener una indicación de la estructura ramificada de una muestra de glucógeno no caracterizada, combine de 25 a 50 microgramos del glucógeno con 650 microlitros del reactivo de color de yodo/cloruro de calcio de trabajo, y proceda como se explicó anteriormente para adquirir el espectro de absorción.