Transferencia de puntos de 5-metilcitosina para determinar el grado de metilación del ADN

La metilación del ADN es una modificación epigenética que implica la adición de un grupo metilo a la base de citosina del ADN para formar 5-metilcitosina. Esta modificación altera la expresión génica.

Para cuantificar la metilación del ADN mediante transferencia de puntos, tome muestras de ADN genómico derivadas de condrocitos humanos en varias etapas de desdiferenciación que exhiben diferentes niveles de citosina metilada.

Trate las muestras de ADN con hidróxido de sodio, un álcali fuerte, y caliéntelas. Este tratamiento rompe los enlaces de hidrógeno entre las dos cadenas de ADN, lo que resulta en la desnaturalización del ADN. Agregue acetato de amonio para neutralizar el álcali, evitando la degradación excesiva del ADN.

Tome una membrana de nailon y localice muestras de ADN desnaturalizadas como puntos. El ADN cargado negativamente se une a la membrana de nailon cargada positivamente a través de interacciones electrostáticas, lo que resulta en su transferencia en el soporte sólido.

Trate la membrana secada con un tampón de bloqueo para evitar una unión inespecífica. A continuación, agregue anticuerpos anti-5-metilcitosina a la membrana e incube. Estos anticuerpos se unen exclusivamente a la citosina metilada en el ADN.

Lave para eliminar los anticuerpos no unidos y agregue anticuerpos secundarios conjugados con enzimas quimioluminiscentes que se unan específicamente a los anticuerpos primarios.

Agregue un sustrato quimioluminiscente a la membrana. La enzima del anticuerpo reacciona con el sustrato para producir quimioluminiscencia, produciendo puntos de varias intensidades.

Tome imágenes de la membrana y mida las intensidades de los puntos, lo que corresponde a la extensión de la metilación del ADN en cada muestra.

Comience este procedimiento desnaturalizando el ADN aislado en hidróxido de sodio 0,1 molar durante 10 minutos a 95 grados centígrados. Neutralice el ADN con acetato de amonio molar en hielo y luego diluya dos veces con agua destilada doblemente.

El paso más crítico en el punto blot es el manchado de las muestras en la membrana, hágalo lenta y cuidadosamente. Trate de minimizar cada área manchada a 3 a 4 milímetros de diámetro.

Con una punta de pipeta de boca estrecha, detecte con cuidado 2 microlitros del ADN genómico diluido en serie en una membrana de nailon cargada positivamente en el centro de la rejilla. Seque la membrana a 80 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, bloquee los sitios de unión de anticuerpos no específicos empapando la membrana en BSA al 5% en TBST en una placa de Petri de 10 centímetros durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.

Después de 1 hora, lave la membrana tres veces en TBST durante 5 minutos cada vez. Incube la membrana con un anticuerpo monoclonal anti-5-metilcitosina de ratón en TBST a 4 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lave la membrana tres veces en TBST durante 5 minutos cada vez.

Luego, incube con un anticuerpo secundario: inmunoglobulina G de oveja conjugada con peroxidasa de rábano picante en TBST durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar la membrana en TBST como antes, agregue el sustrato enzimático a la membrana e incube durante 5 a 10 minutos. Finalmente, visualice la señal de anticuerpos secundarios utilizando un kit de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.