Aislamiento de la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto

Tomemos una corteza cerebral de ratón recién cosechada.

Pica el tejido en pequeños fragmentos. Transfiéralos a un homogeneizador refrigerado que contenga un tampón con inhibidores de la ARNasa y las ADNasas.

Homogeneizar el tejido de forma óptima para liberar las células en suspensión, preservando selectivamente la microglía debido a su capacidad para soportar las fuerzas de cizallamiento y mantener la viabilidad de la membrana, al tiempo que elimina las neuronas y otras células gliales.

Además, los inhibidores de la ARNasa degradan las ARNasas, mientras que las ADNasas degradan cualquier ADN contaminante.

Pase la suspensión celular a través de un filtro celular para eliminar los restos de tejido.

Transfiera la suspensión celular a un tubo. Centrifugar y eliminar el sobrenadante que contiene enzimas. Vuelva a suspender las celdas en un búfer.

Agrega microperlas magnéticas antimielina. Estas microperlas se dirigen a la proteína mielina, uniéndose a los restos de mielina y oligodendrocitos.

Cargue la mezcla de células y perlas en una columna de agotamiento que comprende una matriz con esferas ferromagnéticas.

Bajo el campo magnético aplicado, los restos de mielina y oligodendrocitos unidos a microperlas se retienen dentro de la columna, mientras que las células microgliales pasan.

Lave la columna con tampón y recoja el flujo que contiene microglía.

Primero, use una hoja de afeitar para cortar cada región del cerebro en trozos finos de menos de 1 milímetro cúbico. Con una pipeta de 1 mililitro con la punta cortada, transfiera los trozos de tejido a homogeneizadores Dounce preenfriados. Homogeneice el tejido girando lentamente el pistón hacia adentro y hacia afuera del homogeneizador Dounce durante 6 a 10 carreras completas hasta que no haya trozos visibles. Luego, transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 mililitros a través de filtros de 70 micrómetros.

Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con un total de 6 mililitros de medio frío A, luego transfiera el enjuague a un tubo de 15 mililitros para centrifugar. Centrifugar suspensión unicelular a 400 veces g y a 4 grados centígrados durante 5 minutos con un descanso a 5.

Enjuague una columna de agotamiento grande y tres columnas de selección grandes en un separador magnético con 3 mililitros de MCS. Cuando se complete la centrifugación de las muestras de tejido, pipetee y deseche el sobrenadante sin alterar el sedimento. Vuelva a suspender las células en el tampón MCS que contiene inhibidor de la ARNasa.

Agregue 100 microlitros de perlas de eliminación de mielina a cada tubo que contenga células resuspendidas de la corteza y el cerebelo, y agregue 50 microlitros de perlas de eliminación de mielina a cada uno de los tubos que contienen células resuspendidas del hipocampo y el cuerpo estriado. Incube los tubos en hielo durante 10 minutos.

Después de esto, agregue MCS al tubo que contiene células corticales para aumentar su volumen a 2 mililitros, y a los tubos restantes para aumentar cada uno de sus volúmenes a 1 mililitro. Una vez que las columnas estén vacías de tampón de enjuague, cargue 2 mililitros de células corticales en la columna de agotamiento grande y 1 mililitro de cada suspensión celular en columnas de selección grandes separadas. A continuación, lave la columna de agotamiento grande una vez con 1 mililitro de tampón MCS y lave cada columna de selección grande dos veces con 1 mililitro de tampón MCS para cada lavado.