Preparación de cultivos organotípicos de cortes a partir del hipocampo de un cachorro de rata

Tome el cerebro de un cachorro de rata y separe los hemisferios cerebrales.

Vea la cara medial de un hemisferio cerebral.

Identifique el fórnix, una banda de materia blanca ubicada en el borde medial del hipocampo, y córtela.

Separe el tejido circundante, exponiendo el hipocampo y la fimbria, una estructura curva de tractos de materia blanca.

Deslice una espátula debajo de la fimbria, levante el hipocampo y transfiéralo a un tampón helado.

Coloque los hipocampos de ambos hemisferios en un picador de tejidos y córtelos en rodajas.

Transfiera las rodajas a una membrana de inserción colocada dentro de una placa de cultivo que contenga medios.

Ajuste las posiciones de corte para permitir la difusión de nutrientes y oxígeno. Retire el exceso de tampón para evitar la dilución de los medios de cultivo.

incubar. El revestimiento de la membrana del inserto facilita la adhesión de las lonchas, reduciendo el daño tisular.

Cambiar el medio regularmente para reponer nutrientes, facilitando la neurogénesis del hipocampo y la generación de cultivos organotípicos de cortes.

Con una hoja de bisturí limpia, corte los dos hemisferios del cerebro de una rata aislada. Transfiera el hemisferio izquierdo nuevamente a la placa de Petri grande y coloque el otro, con la pia hacia abajo, en una solución de disección helada.

Vea la cara medial del hemisferio derecho e identifique el borde del fórnix, una banda prominente de materia blanca a lo largo del borde medial del hipocampo. Una vez identificado, corte el fórnix usando solo unos 0,5 centímetros de la hoja del bisturí. Con dos microespátulas, retire el hipocampo colocando la espátula de la mano derecha en el tronco encefálico y levantando la corteza suprayacente con una espátula de la mano izquierda.

Levante suavemente la corteza para revelar el ventrículo lateral y la superficie medial del hipocampo. Una línea curva blanca, la fimbria, ahora debería ser visible. Alinee la curvatura de la espátula con la curvatura de la fimbria y presione suavemente la espátula debajo de la fimbria. Deslice la espátula hacia la izquierda y hacia la derecha a lo largo del eje caudal rostral antes de levantarla en dirección dorsal para eliminar el hipocampo.

Transfiera el hipocampo a una placa de Petri pequeña separada con una solución de disección helada. Repita este procedimiento en el hemisferio izquierdo para extirpar el hipocampo izquierdo. Una vez aislado, transfiera con cuidado el hipocampo a la etapa de corte de tejidos. Colóquelos adyacentes y paralelos entre sí y perpendiculares al eje de la cuchilla del picador. Use un pincel para colocar el pañuelo y agregue unas gotas de la solución de disección sobre el hipocampo.

Corte el tejido en rodajas de 400 micrómetros sin detenerse para quitar rodajas individuales. Después de cortar todo el hipocampo, use un pincel para transferir suavemente las secciones a una pequeña placa de Petri con solución de disección. Bajo un microscopio de disección, separe cuidadosamente las rodajas flotantes con una microespátula y un pincel.

A continuación, retire una placa de cultivo previamente preparada con un inserto de cultivo de la incubadora y colóquela en la campana de flujo laminar. Con una pipeta Pasteur pulida al fuego, extraiga de cuatro a cinco rodajas y colóquelas en la superficie apical de la membrana del inserto de cultivo. Use un pincel para ajustar su espaciado, dejando espacio entre las secciones individuales y el borde del inserto de cultivo.

Una vez en posición, retire el exceso de solución de disección de la superficie apical de la membrana. Vuelva a colocar la placa de cultivo con suero que contenga medio de cultivo y las rodajas del hipocampo en la incubadora a 35 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Alimente los cultivos en una campana de flujo laminar estéril dos días después de la disección. Primero, aspire el medio de cultivo viejo y luego agregue 1 mililitro de suero fresco que contenga medio a los pocillos con una pipeta de vidrio esterilizada. Vuelva a colocar suavemente el inserto de cultivo y tenga cuidado de eliminar las burbujas de aire que puedan haberse formado debajo de la superficie de la membrana. Después de la primera alimentación, cambie el medio cada dos días.