Generación de explante de ganglios de raíz dorsal y cultivo celular disociado

Comience con el ganglio de la raíz dorsal o los tejidos DRG en un medio sin suero. El tejido DRG contiene neuronas sensoriales y células gliales satélite incrustadas en la matriz extracelular, ECM.

Sembréelos en una placa de cultivo recubierta con una mezcla de proteínas gelatinosas para mejorar la adhesión de los tejidos.

Con el tiempo, las células gliales liberan factores de crecimiento neurotróficos que permiten extensiones neuronales, estableciendo un cultivo de explantes DRG.

Para desarrollar un cultivo celular disociado, tome estos explantes de DRG en un tubo. Trátelos con colagenasa para degradar la ECM y luego con tripsina, que interrumpe las conexiones celulares, liberando neuronas y células gliales.

Añadir un medio enriquecido con sérum para detener la reacción enzimática.

Pipetea el contenido repetidamente para crear una suspensión unicelular y fíltralo para eliminar los residuos.

Centrifugar esta suspensión celular y eliminar el sobrenadante que contiene enzimas.

Vuelva a suspender las células en un medio neurobasal y transfiéralas a una placa recubierta de laminina.

Las células gliales satélite y las neuronas sensoriales se adhieren a la placa recubierta de laminina, estableciendo un cultivo celular disociado.

Transfiera cada DRG a una placa de Petri de vidrio seco. Bajo un microscopio quirúrgico, limpie y recorte el exceso de fibras y tejido conectivo que aún están adheridos al DRG con una cuchilla. El GRD es fácilmente identificable como una estructura abultada y transparente a lo largo del nervio espinal blanco y los vasos sanguíneos que a menudo se encuentran alrededor del GRD.

Después de eso, coloque el DRG limpio en una nueva placa de Petri que contenga medios helados y sin suero. Diluya la mezcla de proteínas gelatinosas en medios helados y sin suero en una proporción de 1 a 1. Luego, coloque el DRG ex vivo en las placas de 12 pocillos, prerecubiertas con 10 o 20 microlitros de mezcla de proteínas gelatinosas, y manténgalas a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos.

Ahora, agregue suavemente de 1,5 a 2 mililitros de medios sin suero al sistema de cultivo para cubrir todo el explante y mantener los explantes en condiciones de cultivo. Cambie el medio de crecimiento DRG cada 72 horas. y dejar que el DRG crezca durante el tiempo que sea necesario.

Este es un paso crítico ya que el DRG se ancla a la placa de vidrio utilizando la mezcla de proteínas gelatinosas. Por lo tanto, el tiempo de polimerización y las habilidades de pipeteo son fundamentales para evitar la flotación.

En este procedimiento, coloque todo el DRG recolectado en un tubo estéril de 1,5 mililitros con medios F12 que contengan colagenasa IV e incube a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Luego, reemplace el medio nuevo que contiene colagenasa IV e incube la muestra durante otros 45 minutos. Luego, trate los explantes con 2 mililitros de medios F12 que contengan tripsina al 0,025% a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Inmediatamente después del tratamiento con colagenasa IV, incubarlos con 2 mililitros de medios F12 que contengan suero bovino fetal a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después, lavar los explantes tres veces con 2 mililitros de medio F12, y proceder a disociarlos mecánicamente con una pipeta de vidrio, hasta que el medio se vuelva turbio.

A continuación, filtre el cultivo celular disociado a través de un filtro de 0,22 micrómetros para eliminar las impurezas y el exceso de tejido conectivo. Luego, centrifugar el lisado celular filtrado durante dos minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 500 microlitros de medios neurobasales. Coloque las células disociadas en portaobjetos recubiertos de laminina con una densidad celular preferida.