Establecimiento de un cultivo de células gliales de Müller obtenido de retinas de ratón

Tomemos retinas de ratón que contienen células Müller glial, o MG, y neuronas.

Colóquelos en una solución de disociación con enzimas digestivas e incube con un balanceo suave para garantizar una distribución uniforme de las enzimas.

Estas enzimas descomponen la matriz extracelular, desprendiendo células individuales.

Pipetea las retinas hacia arriba y hacia abajo varias veces para liberar las células.

Agregue un inhibidor para detener la actividad enzimática, luego centrifuge.

Deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender las células en un medio que contenga un factor de crecimiento específico para las células MG.

Transfiera las células a un pozo e incube.

Con el tiempo, el factor de crecimiento en el medio facilita el crecimiento y la multiplicación de las células MG mientras que las células neuronales que no se dividen perecen.

Retire el medio. Lavar con un tampón de sal.

Incubar con una enzima digestiva para separar las células del pozo.

Recoge las células en un tubo y luego centrifuga.

Deseche el sobrenadante que contiene las células neuronales muertas.

Vuelva a suspender las células MG en el medio para su posterior análisis.

Prepare la mezcla de disociación de papaína ADNasa I como se describe en el manuscrito. Ahora, con una pipeta de transferencia con punta agrandada, levante las retinas. Espere hasta que las retinas se asienten en la parte inferior de la punta y libere las retinas, sin exceso de HBSS, en el tubo que contiene la mezcla de papaína ADNasa I.

A continuación, coloque el tubo en una nutadora en la incubadora e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados y con dióxido de carbono al 5%. A continuación, disocie las células pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mililitro. Después de disociar las células, agregue 275 microlitros de inhibidor de la proteasa ovomucoide del kit de disociación de papaína para neutralizar la papaína y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Coloque los tubos en una centrífuga y gírelos a 4 grados centígrados durante 8 minutos a una fuerza centrífuga relativa de 300. Agregue el factor de crecimiento epidérmico al volumen calculado del medio de crecimiento precalentado a 37 grados Celsius. Retire los tubos con cuidado de la centrífuga.

Sin tocar el gránulo en la parte inferior del tubo, retire el sobrenadante con cuidado y por completo. Ahora, vuelva a suspender el gránulo celular con 500 microlitros de medio de crecimiento suplementado con factor de crecimiento epidérmico. Luego, transfiera la suspensión celular a un pocillo de la placa de 12 pocillos etiquetada. Enjuague el tubo con otros 500 microlitros del medio de crecimiento suplementado con factor de crecimiento epidérmico y agréguelo al pozo.

Agite la placa del pozo con cuidado. Luego, coloque la placa en la incubadora a 37 grados centígrados con dióxido de carbono. Comience verificando la confluencia celular del 90% al 100%. A continuación, retire el medio y agregue 1 mililitro de HBSS frío para lavar el pozo. Agite suavemente la placa y retire HBSS sin dejar rastros.

Posteriormente, añadir 500 microlitros de una solución precalentada que contenga tripsina para separar las células del pocillo. Balancee suavemente e incube durante 2 minutos en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de mover la placa de la incubadora a la cabina de bioseguridad, aspire la solución que contiene tripsina mientras la inclina. Dispersarlo con cuidado y lentamente sobre el pozo varias veces, hasta que las células se desprendan por completo.

A continuación, transfiera esta suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros y coloque los tubos en la centrífuga. Centrifugar a 300 veces g durante 8 minutos a 4 grados centígrados y volver a introducir los tubos en la cabina de bioseguridad. Retire el sobrenadante sin tocar el gránulo. Ahora, vuelva a suspender cuidadosamente el gránulo celular agregando 600 microlitros de medio de crecimiento precalentado y pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente de 30 a 40 veces.