Registros electrofisiológicos para la evaluación de las regeneraciones neuronales en cortes de médula espinal cocultivados

Tome una matriz de electrodos múltiples recubierta de polímero o MEA, con cortes de médula espinal embrionarios cocultivados colocados en dos zonas separadas, lo que permite el registro simultáneo de ambos cortes.

El corte muestra conexiones neuronales regeneradas en el área previamente lesionada.

Coloque el MEA en una cámara de registro que contenga una solución extracelular rica en iones y nutrientes para mantener la supervivencia neuronal.

Permitir que el sistema se estabilice, facilitando la adaptación y comunicación neuronal.

Las neuronas se comunican a través de señales eléctricas llamadas potenciales de acción, que son registradas por los electrodos cercanos en el MEA.

Las señales individuales de cada electrodo se combinan, produciendo una señal eléctrica de cada corte.

Reemplace regularmente la solución extracelular para mantener la estabilidad de las neuronas.

Agregue una solución extracelular con inhibidores que bloquean los receptores de neurotransmisores inhibidores en las membranas neuronales, manteniendo las neuronas activas durante más tiempo.

Compare la actividad eléctrica de ambos cortes. Una señal eléctrica sincronizada entre los dos cortes confirma las conexiones sinápticas y la regeneración neuronal exitosa.

Coloque una placa de Petri con una matriz de microelectrodos recubierta en el interior bajo un microscopio estereoscópico. Enfoque la matriz y centre una gota de plasma de pollo de seis microlitros en la matriz de electrodos. Con una espátula pequeña, deslice con cuidado dos secciones de la médula espinal con sus lados ventrales uno frente al otro en la gota de plasma.

A continuación, agregue ocho microlitros de trombina alrededor de la gota de plasma de pollo. Luego, use la punta de la pipeta para mezclar y esparcir cuidadosamente la mezcla de plasma de pollo y trombina. Justo antes de que la mezcla de plasma de pollo y trombina se vuelva demasiado fibrosa y comience a coagularse, aspire el exceso de líquido. Luego, tape la placa de Petri y colóquela en una cámara humidificada.

Coloque la cámara dentro de una incubadora a 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora. Después de la incubación, agregue cuidadosamente 10 microlitros de medio nutritivo a la muestra. Tape la placa de Petri y vuelva a colocarla en la incubadora durante 45 minutos más. A continuación, coloque cada uno de los conjuntos de cultivo de matriz de electrodos múltiples en un tubo de rodillo y agregue tres mililitros de medio nutritivo. Cierre bien la tapa y coloque el tubo de rodillo en el tambor de rodillos. Gire el tambor a 1 a 2 RPM en la incubadora a 37 grados centígrados.

Con unas pinzas estériles con punta de goma, retire los conjuntos de cultivo de matriz de electrodos múltiples del tubo de rodillo y colóquelos en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico. Enfoca el pañuelo y verifica que las dos rodajas estén fusionadas. A continuación, mantenga el conjunto firme y coloque una hoja de bisturí en la ranura de la matriz de electrodos múltiples cerca de las rodajas de tejido. Sostenga el bisturí en horizontal y luego levante el mango del bisturí, pero deje que la hoja del bisturí permanezca en la ranura de la matriz de tal manera que la hoja ruede desde la base hasta la punta, cortando el tejido y cubriendo la ranura.

Corta cualquier conexión de tejido residual con una punta de aguja de calibre 25 si es necesario. Trabaje solo en el área dentro de la ranura y no toque los bordes sensibles. Vuelva a colocar los conjuntos de cultivo de matriz de electrodos múltiples en el tubo del rodillo y agregue tres mililitros de medio nutritivo fresco a los cultivos. Luego, vuelva a colocar el tubo de rodillo en el tambor de rodillos de la incubadora a 37 grados centígrados.

Monte un conjunto de cultivo de matriz de electrodos múltiples en una cámara de registro y aplique aproximadamente 500 microlitros de solución extracelular a la matriz. Luego, monte el ensamblaje en el microscopio. Espere 10 minutos para que el sistema se estabilice y luego, registre la actividad espontánea básica de cada uno de los electrodos de detección de actividad durante 10 minutos. Repita las grabaciones un total de dos veces.

Para garantizar condiciones extracelulares estables, cambie la solución extracelular después de cada sesión de grabación. Si lo desea, desinhiba la red aplicando una solución extracelular que contenga un micromolar de estricnina y 10 micromolares de gabazina y espere al menos dos minutos antes de registrar la actividad eléctrica.