Estudio del efecto de los plaguicidas en las neuronas de Caenorhabditis elegans

Comience con una placa de agar que contenga Caenorhabditis elegans transgénicos que expresan proteínas fluorescentes verdes o GFP en sus neuronas.

Agregue agua estéril al plato, gírelo para levantar los gusanos y transfiéralos a un tubo.

Deje que los gusanos se asienten, luego retire el exceso de agua y vuelva a suspenderlos.

Transfiera los gusanos resuspendidos a una placa recubierta de pesticida y una placa de control sin pesticida, luego incube.

En función de sus acciones, el pesticida daña específicamente ciertas neuronas y causa hinchazón neuronal, disminuyendo la expresión de GFP.

Transfiera los gusanos a una almohadilla de agarosa que contenga un agente anestésico, luego coloque un cubreobjetos.

Monte el portaobjetos en un microscopio fluorescente. Primero, visualice los gusanos usando el modo de contraste de fase, luego cambie al modo de fluorescencia.

En los gusanos tratados con pesticidas, las neuronas exhiben fluorescencia reducida, somas hinchados y brechas en los procesos neuronales, lo que indica efectos neurodegenerativos.

Mientras están en control, las neuronas sanas muestran un soma intacto con fluorescencia brillante.

Con una micropipeta, coloque 1 mililitro de agua estéril en la placa de nematodos. Luego, agite el agua para levantar los nematodos. Luego, retire el líquido con los nematodos a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros. Después de 10 minutos, a medida que los nematodos se asientan por gravedad, retire con cuidado al menos 500 microlitros de agua y deséchelos.

Luego, vuelva a suspender los nematodos y, con una punta de pipeta amarilla cortada, retire de 50 a 100 microlitros de gusanos suspendidos a cada placa de tratamiento, asegurándose de que cada placa tenga al menos 10 gusanos adultos. Prepare dos portaobjetos colocando un trozo de cinta adhesiva en un solo lado del portaobjetos para formar una almohadilla de grosor uniforme.

Luego, coloque una corredera limpia y sin usar entre ellos en la mesa de trabajo. Coloque una gota de 10 microlitros de agarosa derretida en el centro del portaobjetos con una micropipeta. Luego, aplana la gota colocando otro portaobjetos limpio en la parte superior perpendicular al portaobjetos con la gota y aplica presión para que la gota de agarosa forme el grosor de la cinta de etiquetado.

Luego, aplique una presión constante para separar las dos diapositivas. Luego, apoye el portaobjetos con el lado de agar hacia arriba sobre la mesa de trabajo y déjelo secar durante uno o dos minutos antes de usarlo. Para agregar nematodos al portaobjetos preparado con la almohadilla de agarosa, agregue una gota de agua de 5 microlitros que contenga 1 molar de azida de sodio a la almohadilla de agar, que anestesiará a los gusanos y los movilizará.

Luego, transfiera al menos 10 nematodos por portaobjetos de tratamiento a la gota con un palillo de gusanos, que debe esterilizarse antes y después de transferir los nematodos. A continuación, agregue un cubreobjetos con fórceps colocándolo en ángulo y bajándolo lentamente.

Luego, coloque la montura húmeda preparada en un microscopio fluorescente para observar los gusanos, primero con un aumento de 10x y contraste de fase, luego con un aumento de 40x con contraste de fase e iluminación fluorescente.

Coloque una montura húmeda preparada a la vez en la platina del microscopio y asegúrela en su lugar con los clips de la platina del microscopio. Luego, comience a ver las monturas húmedas con el objetivo de aumento más bajo, que suele ser de 10x. y use un campo brillante o contraste de fase para visualizar y enfocar los nematodos.

Una vez que un nematodo se encuentra en el campo de visión, concéntrelo con la perilla de enfoque fino del microscopio. Luego, cambie la iluminación a fluorescencia girando el dial y dirija la luz a la cámara para capturar las imágenes digitales.

A continuación, ajuste la iluminación con el software de imágenes para que las neuronas estén brillantemente iluminadas, pero no sobresaturadas. En algún momento, obtenga una imagen separada de una regla con el mismo aumento que las imágenes de celda para proporcionar una escala de aumento para su figura.