Tinción de inmunofluorescencia de cerebros de Drosophila para la obtención de imágenes unicelulares de células gliales

Comience con los cerebros de moscas Drosophila transgénicas, que contienen diferentes tipos de células gliales que albergan un sistema de recombinasa específico de células.

Impulsa la expresión de una proteína de la superficie celular fusionada con diferentes epítopos antigénicos en el mismo tipo de células.

Tratar el tejido con un fijador para reticular proteínas y preservar la arquitectura del tejido.

Lavar para eliminar el exceso de fijador.

Agregue proteínas de bloqueo para enmascarar sitios de unión no específicos para reducir la tinción de fondo.

Incubar el tejido con un cóctel de anticuerpos primarios que se une a los diferentes epítopos expresados en las células gliales.

Lavar para eliminar los anticuerpos primarios no unidos.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se unen a los anticuerpos primarios.

Lavar para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.

Monte el cerebro dentro de un espaciador de imágenes y coloque un cubreobjetos. El espaciador crea una cámara para el tejido, preservando su estructura tridimensional.

Diferentes células del mismo tipo glial marcadas con diferentes anticuerpos conjugados con fluoróforos permiten comprender las interacciones célula-célula.

Transfiera los cerebros aislados con una punta de pipeta P10 a un tubo de microcentrífuga de 200 microlitros con solución fijadora. Nunca manipule los cerebros con fórceps. Incubar los tejidos protegidos de la luz. Evite aspirar los cerebros durante las transferencias de solución.

Para quitar el fijador, use tres o más lavados de 15 minutos con solución de lavado. Luego, bloquee los tejidos con una solución bloqueadora durante 30 minutos o más. A continuación, reemplace la solución de bloqueo con anticuerpos primarios diluidos en solución de lavado e incube los cerebros durante la noche a 4 grados centígrados.

Para eliminar los anticuerpos primarios, use tres lavados de 1 hora en solución de lavado. A continuación, agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos secundarios en la solución de lavado e incube los cerebros durante la noche a 4 grados centígrados o durante 4 horas a temperatura ambiente. Para eliminar completamente los anticuerpos no unidos, use tres lavados de 1 hora en solución de lavado, seguidos de un lavado más prolongado con PBS.

Luego, monta los cerebros. Prepare dos cubreobjetos con un espaciador de imágenes. En el espaciador, y en el cubreobjetos adicional, aplique 10 microlitros de medio de montaje con un agente antidecoloración. A continuación, con una pipeta P10, transfiera los cerebros al cubreobjetos, depositándolos junto al medio junto con un poco de PBS. No deje que el pañuelo se seque.

Ahora, mueva con cuidado los cerebros al medio de montaje, usando la pipeta. Y finalmente, muévalos al medio en el espaciador y colóquelos con fórceps. Luego, retire el revestimiento adhesivo de los espaciadores y coloque un cubreobjetos. Asegure el cubreobjetos con un poco de presión con fórceps y proceda inmediatamente con las imágenes.