Imágenes de neuronas motoras marcadas con fluorescencia en una pata adulta de Drosophila

Comience con una configuración de microscopio confocal que contenga una pata fija de Drosophila modificada genéticamente montada dentro del espacio entre dos cubreobjetos. Los axones de las neuronas motoras en la pierna expresan una proteína fluorescente marcada con membrana.

Use un solo láser y dos detectores para capturar señales fluorescentes de los axones de las neuronas motoras y la autofluorescencia de fondo de la cutícula, que es la capa más externa de la pierna.

Ajuste la configuración de imágenes para obtener una resolución y calidad de imagen óptimas.

Ajuste el brillo para garantizar una señal axonal brillante y una autofluorescencia saturada de la cutícula.

Capture una imagen con señal axonal y autofluorescencia de la cutícula.

Utilizando el software de procesamiento de imágenes adecuado, abra la imagen capturada.

Divida los canales y reste la autofluorescencia de la cutícula de fondo de la señal axonal.

Ajuste el brillo y el contraste de ambas señales para mejorar la claridad de la imagen.

Combine los canales para generar una imagen combinada para visualizar los axones de las neuronas motoras dentro del segmento de la pierna.

Para obtener imágenes de las patas, use el láser de 488 nanómetros y dos detectores simultáneamente para configurar la primera pista para obtener tanto la GFP como la autofluorescencia de la cutícula. Seleccione un objetivo de inmersión en aceite de 20 a 25x y establezca la resolución en 1024 por 1024 píxeles, con una profundidad de 12 bits. Y establezca el espaciado z en 1 micrómetro. Cargue el portaobjetos en la platina del microscopio.

Y usando la misma potencia láser para ambos detectores, ajuste la ganancia del primer detector para obtener una señal GFP brillante. Y ajuste el segundo detector para asegurarse de que algunas áreas con una señal de cutícula alta produzcan una señal saturada en este detector. A continuación, crea una imagen de las patas, utilizando el mosaico o las opciones de posición para capturar toda la pata, si una pierna está extendida o es demasiado grande para ser fotografiada en un solo fotograma.

Para el procesamiento de imágenes, abra la pila confocal en ImageJ Fiji. Y use el complemento de formatos para abrir cualquier imagen que no esté en formato TIFF. Para dividir los canales, seleccione Imagen, Color y Dividir canales. Para restar la señal de cutícula de la señal GFP, abra Calculadora de procesos e imágenes y seleccione la pila del detector uno como Imagen1.

En la ventana de operación, seleccione Restar y seleccione la pista del detector 2 como Imagen2, de modo que solo se obtenga la señal GFP endógena. Utilice Image, Stacks, Z Protect para generar una proyección de intensidad máxima para la señal GFP endógena. Utilice los controles de la ventana de control de brillo para ajustar el brillo y el contraste.