La disección del corazón en las larvas, juveniles y adultos de pez cebra, Danio rerio

El objetivo general de este procedimiento es extraer el corazón del pez cebra. Esto se logra primero recolectando y fijando peces cebra. A continuación, se abre la cavidad corporal para visualizar el corazón.

Luego, se extrae el corazón y se limpia de tejido no cardíaco. Por último, se fotografía el corazón. En última instancia, la morfología del corazón a lo largo del tiempo se puede ver a través de la microscopía, el seccionamiento y la fotografía.

La demostración visual de este método es fundamental como clave para la disección. Los peces cebra son difíciles de aprender porque los peces cebra son pequeños y los tejidos no son de color distinto y pueden ser difíciles de identificar para generar peces cebra desde las larvas hasta las etapas adultas. Para estos experimentos, realice apareamientos individuales o grupales con peces adultos.

Limpia los embriones y guárdalos en una incubadora a 28 grados centígrados. Cinco días después de la fertilización, separe los peces en tanques con una densidad de 10 a 15 peces y colóquelos en la instalación de peces. Retire el pez de su tanque a la edad adecuada y colóquelo en 0.2% Trica para anestesiarlo.

Coloque el pez anestesiado en agua helada durante 15 minutos para practicarle la eutanasia. Mientras tanto, agregue 4% de formaldehído o PFA en un XPBS a un plato. Incubar los peces recolectados en el PFA al 4% durante una o dos horas a temperatura ambiente, luego durante la noche a cuatro grados centígrados en una placa de Petri envuelta en perfil.

Esto mantiene el pez plano y hace que la disección sea mucho más fácil después de la fijación. Enjuague dos veces en PBS con 0.1%Tween o PBT, el pescado se puede mantener en PBT a cuatro grados Celsius hasta por 10 días. Coloque un solo pez en una placa de Petri, llena hasta la mitad con PBS fresco y colóquelo sobre su lado derecho.

Mida la longitud del pez desde el hocico hasta la base de la cola, sin incluir las aletas de la cola con un calibrador digital milimétrico. Esta es la longitud estándar o sl. Asigne a cada pez una combinación de letras numéricas para permitir que un pez individual y el corazón diseccionado resultante sean rastreados para su posterior análisis.

Ingrese todos los datos, incluidas todas las mediciones, en una hoja de cálculo y organícelos en función de estas etiquetas antes de la disección. Etiquete las tiras de tubos de PCR con el número de seguimiento asignado y llene los tubos con PVT u otra solución apropiada para su posterior análisis. Oriente el sitio ventral del pez hacia arriba en una placa de Petri mientras estabiliza el cuerpo con pinzas, sosteniendo la cabeza entre los ojos y las branquias para peces de menos de 12 milímetros de longitud estándar.

Usando pinzas afiladas o una microaguja en un soporte de alfiler. Retira los músculos pectorales y las aletas del cuerpo para revelar el corazón. El movimiento constante de las pinzas durante la disección puede causar corrientes en el PPT que mueven a los peces.

Esto es particularmente problemático para los peces más pequeños. Por lo tanto, se debe usar una microaguja para eliminar los músculos pectorales y la aleta y abrir la cavidad corporal. Use las pinzas para sacar suavemente el corazón de la cavidad desde debajo de la aurícula.

Si el pez contiene un marcador cardíaco fluorescente, use un endoscopio fluorescente para la disección y verifique la extracción del corazón por fluorescencia. Una vez que se extrae el corazón de la cavidad, se usan las pinzas para sujetar el corazón y una microaguja para extraer el tejido no cardíaco adicional y el revestimiento epicárdico del exterior del corazón. Para peces de más de 12 milímetros de longitud estándar.

Con unas microtijeras con mango de resorte, haga tres incisiones. Primero, haz un corte transversal a través de las branquias. En segundo lugar, haz otro corte transversal en la parte anterior del abdomen.

Y en tercer lugar, hacer un corte sagital en el lado ventral conectando ambos cortes transversales. Con pinzas afiladas, retire los músculos pectorales y las aletas del cuerpo para abrir la cavidad corporal y revelar el tejido plateado del pericardio. Si se extirpa este tejido pericárdico, el corazón se hará visible.

Utilice las micro tijeras para cortar la arteria conectada al bulbo arterioso ubicado por encima del corazón. Una vez que se corta esta arteria, coloque las puntas de las pinzas debajo de la aurícula y use las pinzas para sacar el corazón de la cavidad. Si hay tejido adicional que viene con el corazón, está bien, ya que se puede extirpar más tarde.

Alternativamente, en algunos peces, es posible extirpar el corazón tirando suavemente del bulbo hacia afuera y el resto del corazón seguirá. Tenga cuidado con la ubicación de la aurícula si utiliza la técnica alternativa, ya que puede dañarse fácilmente. Si hay tejido adicional que viene con el corazón, esto está bien y se puede eliminar después.

Una vez que se extrae el corazón de la cavidad, use las dos pinzas para sostener el corazón y extraer el tejido adicional o un par de pinzas para sostener el corazón y una microaguja para extraer el tejido no cardíaco adicional. Para fotografiar el corazón del pez cebra, prepare una placa de Petri de agar nutriente de 23 gramos por litro y cubra el agar solidificado con PBS. Use las pinzas para hacer un hueco en el agar que permita que el corazón encaje en la orientación adecuada.

Retire el corazón del tubo de PCR sosteniendo la punta del bulbo. Con las pinzas firmemente. Coloca el corazón en el plato de agar.

Orienta el corazón en el agar para fotografiar. La muestra se puede girar después de cada imagen a todas las orientaciones posibles. Usa los tiempos de exposición aéreos, ligeros y cortos para fotografiar los corazones.

Realice ajustes en la calidad de la luz utilizando la exposición según sea necesario para obtener la mejor fotografía. Aquí se muestra un ejemplo de un corazón limpio bien diseccionado. Cada corazón tendrá algunas diferencias en la morfología general, pero el corazón debe estar completo, con una aurícula ventricular intacta y una arteriosis bulbosa después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo cardíaco del pez cebra exploraran la maduración cardíaca en varias etapas del desarrollo del pez cebra.