Generación de microesferas de alginato para aplicaciones biomédicas

Mi nombre es Goldie Ana, y soy una estudiante de pregrado que trabaja en el laboratorio del Dr. Eric Bras en el Instituto de Tecnología de Illinois. En esta presentación de video, describiré técnicas para el uso de microperlas de algina en ingeniería biomédica, específicamente en el campo de la ingeniería celular y de tejidos. Todo el trabajo descrito aquí se ha realizado en colaboración con el laboratorio del Dr. Emmanuel OPA en el Instituto Wake Forest de medicina regenerativa.

Presentaré técnicas para fabricar microesferas de ginebra para su uso tanto en la administración de fármacos como en la encapsulación de células. Por último, voy a demostrar un procedimiento novedoso que hemos desarrollado en nuestro laboratorio para generar microcápsulas de álgebra multicapa que se pueden utilizar para el doble propósito de célula y proteína. Encapsulación El alginato está compuesto por residuos de ácido beta D ónico y ácido alfa lurónico en secuencias variables.

La solución de alginatos se entrecruza para formar un gel en presencia de un catión multivalente, como el calcio dos plus, que es el más utilizado. Los investigadores han investigado el uso de microperlas de algen para la encapsulación de células y proteínas. Las propiedades de los hidrogeles algénicos pueden variarse en función de sus condiciones de síntesis con propiedades inherentemente diferentes, que, por ejemplo, pueden utilizarse para ajustar la cinética de liberación.

Las microesferas de alginato se han utilizado para muchas aplicaciones muy variadas, como la encapsulación de proteínas, la administración de fármacos, la encapsulación de células y como ingrediente en la ciencia de los alimentos, como la gastronomía molecular. Comenzamos haciendo una solución de alginato en la capa interna. Agregue 25 milimolares de cloruro de sodio, 118 milimolares de cloruro de sodio, 5.6 milimolares de cloruro de potasio y 2.5 milimolares de cloruro de magnesio al agua desionizada, agite bien para asegurarse de que todos los reactivos se hayan disuelto.

Ajuste el pH a 7.4, lo cual es consistente con las condiciones fisiológicas. Mida todo el polvo para obtener la concentración deseada y transfiéralo a la solución interalergénica preparada. Coloque la solución en una máquina de vórtice hasta que todo el polvo se haya disuelto, lo que da como resultado una solución viscosa y transparente.

Prepare la solución de reticulación agregando 10 milimolares de tampón heis y 100 milimolares de cloruro de calcio en agua desionizada. Agite bien la solución y ajuste su pH a 7,4. Agregue 10 mililitros de solución de reticulación a un vaso de precipitados.

Transfiera el alginato a una jeringa provista de una aguja del calibre deseado. Coloque la aguja perpendicular a la solución de reticulación y expulse lentamente las gotas en la solución de reticulación, permitiendo la formación de perlas esféricas para fabricar un gran volumen de microperlas de tamaño constante. Se puede utilizar una microencapsulación de error de dos canales.

Cargue la solución de algenato en la jeringa y abra la válvula de la camisa de aire, seguida de la válvula de la camisa de alginato, lo que permite que las gotas se expulsen en un matraz que contiene solución de reticulación. Deje que las perlas se incuben en la solución durante 15 minutos. Las microperlas deben lavarse tres veces con una solución de 22 milimolares.

El cloruro de calcio y los microcaps de alógeno salino normal se han investigado ampliamente para la encapsulación de células. Por ejemplo, un método propuesto para tratar la diabetes tipo uno consiste en trasplantar párpados de donantes a un paciente para evitar el rechazo de las células autólogas. Sin embargo, los pacientes deben tomar medicamentos inmunosupresores que comprometen su sistema inmunológico.

Encapsulado de alis dentro de un contenedor. Materiales como el algínico pueden obviar la necesidad de fármacos inmunosupresores. Se agrega un recubrimiento de poliol ornitina o PLO alrededor del microbio algínico que serviría como una membrana semipermeable.

Se añade una fina monocapa de alginato alrededor del recubrimiento de PLO que ayuda a limitar la respuesta inflamatoria. El PLOI cargado positivamente interactúa irónicamente con el alginato, lo que da como resultado un recubrimiento alrededor de la cuenta que sirve como una membrana selectiva permanente. A continuación, se crea una monocapa de alginato alrededor del recubrimiento de PLO para enmascarar su carga positiva y limitar la respuesta inflamatoria.

Después del trasplante, cree una solución al 0,1% de poli l ornitina disolviendo PLO en solución salina normal. Agregue la solución de PLO a las microesferas de alginato y colóquelas en un vórtice durante 30 minutos para permitir que las microesferas de algeno tengan tiempo suficiente para interactuar con la solución de PLO. Retire el líquido circundante y realice tres lavados durante dos minutos cada uno con cloruro de calcio de 22 milimolares en solución salina normal.

Agregue una solución de alginato a las microperlas recubiertas de PLO y colóquelas en un vórtice durante cinco minutos. Realice tres lavados durante dos minutos cada uno, utilizando una solución salina normal de 0,9 para eliminar cualquier solución alginica no unida. Después de completar los lavados, puede almacenar las perlas colocándolas en una solución de cloruro de calcio.

Una de las limitaciones de la célula es que muchas células mueren debido a la falta de un suministro de sangre patentado que entregue oxígeno, glucosa y otros nutrientes vitales a las células tras el trasplante de angiogénesis, el crecimiento de los vasos sanguíneos de los vasos sanguíneos preexistentes se puede estimular mediante la entrega de proteínas angiogénicas terapéuticas como el factor de crecimiento de fibroblastos uno o FGF uno, o factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF. Nuestro laboratorio ha demostrado previamente que un nivel bajo y constante de liberación de FGF uno promueve una vascularización estable en comparación con una dosis alta en bolo. Hemos desarrollado un procedimiento novedoso para crear microesferas algénicas de múltiples capas, la capa algínica externa de tamaño considerable en lugar de simplemente una monocapa delgada que se usa tradicionalmente.

Nuestro sistema de administración de fármacos cumple el doble propósito de encapsulación de células y proteínas, donde, por ejemplo, s se puede encapsular en el núcleo interno y proteínas angiogénicas como FGF one en la región algínica externa. La liberación de proteínas terapéuticas costaría la formación de nuevos vasos sanguíneos hacia los sitios de trasplante, aumentando así la viabilidad de las células insulares. El alérgeno multicapa en las microperlas cumple el doble propósito de encapsulación de células y proteínas.

Alrededor del recubrimiento de PLO se crea una región de alérgenos externa considerable en lugar de una monocapa que se usa convencionalmente y se puede usar como región para la encapsulación de proteínas. La liberación de proteínas terapéuticas de la región algínica externa serviría para provocar el brote de vasos hacia el sitio del trasplante. Esto, en teoría, proporcionaría un suministro de sangre patentado que distribuye nutrientes vitales a las células encapsuladas, aumentando así la viabilidad de la célula.

El procedimiento para hacer microperlas de algenato de múltiples capas es similar al discutido anteriormente. Se sintetizan microperlas de algenato que contienen células, seguidas de la construcción de un recubrimiento de PLO. Sin embargo, en el paso final, la capa exterior se crea mediante la reticulación del alginato en una solución de cloruro de calcio en lugar de con solución salina.

Para crear microperlas de ginnet multicapa, comience transfiriendo las microperlas recubiertas de PLO contenidas en solución a un filtro de células para eliminar el exceso de líquido, transfiera las perlas a una superficie plana como un perfil o una placa de Petri, transfiera la solución de alérgenos exterior encima de las microperlas y deje que se incube durante 45 minutos. A continuación, elimine el exceso de solución de alérgenos exterior con una pipeta, transfiera las microperlas a una solución de cloruro de calcio, reticulando así el alginato para formar la capa exterior. Realiza tres lavados de dos minutos cada uno.

Utilizando un panel de cloruro de calcio y solución salina de dos milimolares. A muestra la superficie de una microperla de ginnet, que contrasta con el panel B, donde se puede ver una capa externa de alérgenos considerable. El panel C muestra una imagen de una microperla de algenato multicapa con proteína marcada con fluorescencia encapsulada en la capa externa.

El tamaño de la capa externa de algenato puede variar en función de la composición y la concentración de algenato utilizado, se utilizó el perfil de liberación de FGF uno a partir de alginato multicapa. Las microperlas pueden variar en función de las condiciones utilizadas para sintetizar la capa exterior. Todas las condiciones proporcionan una liberación en ráfaga dentro de las primeras cuatro horas, pero continuando liberando FGF uno durante un máximo de 30 días.

La liberación a largo plazo de FGF tiene el potencial de estimular la vascularización persistente que serviría para aumentar la viabilidad de las células encapsuladas. Eso nos lleva al final de nuestra presentación. Esperamos que le resulte informativo. Tú.