En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

El objetivo general de este procedimiento es inhibir o disminuir la expresión de una proteína específica en la aleta de cola de pez cebra adulta en regeneración. Esto se logra amputando primero la aleta caudal y permitiendo que se regenere una pequeña cantidad de tejido. A continuación, la solución morpho se microinyecta en cada blasa en la mitad de la aleta.

A continuación, el fenotipo morph se electropora en las células de la blasa, y la otra mitad de la aleta se electropora con fines de control. Por último, se analiza el efecto de la reducción de la expresión de la proteína diana en el crecimiento regenerativo. En última instancia, los resultados muestran la inhibición de la regeneración tisular a través del análisis comparativo del crecimiento regenerativo de las mitades inyectadas y no inyectadas de la aleta.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de cicatrización de heridas y la medicina regenerativa debido al potencial para descubrir genes y vías de señalización que son esenciales para la generación de tejidos. Para preparar fluoresceína marcada con morino, diluya 300 nanomoles en 100 microlitros de agua libre de nucleasas. Para hacer una solución de aproximadamente tres milimolares, alícuota la solución en múltiples tubos de microcentrífuga sellados con parafina y almacene a temperatura ambiente lejos de la luz. Para determinar la concentración exacta de morfo, consulte el protocolo escrito para obtener detalles.

Anestesiar peces cebra adultos en trica o etanol de dos fenoxi a un miligramo por mililitro en el agua del tanque. Cuando el pez esté completamente anestesiado, colóquelo en la tapa limpia de una placa de Petri y con un bisturí estéril o una cuchilla de afeitar amputar la aleta proximal al primer punto de ramificación traqueal lipídica. Es importante cortar la aleta perfectamente perpendicular al plano anteroposterior del animal porque los cortes en ángulo darán como resultado un crecimiento desigual de las aletas dorsal y ventral de la aleta. Regrese el pez al tanque y manténgalo a 33 grados centígrados para aumentar la tasa de regeneración según el peso del diseño experimental.

De cero a dos días después de la amputación para la regeneración de la aleta. Para comenzar antes de introducir el morpho, el día antes de la inyección de morpho, haga una placa de inyección con 2% de agarosa que tenga una muesca cortada en un extremo del pocillo, lo que ayudará a estabilizar el pez para el procedimiento de inyección. Justo antes de inyectar, diluya el morfo marcado con fluoresceína y el agua libre de ARN y ADN a la concentración adecuada e incube en un baño de agua a 65 grados Celsius.

Durante cinco minutos, cargue una aguja de inyección previamente preparada y corte la punta en ángulo. A continuación, anestesia al pez y colócalo en la placa de inyección. Retire todo el exceso de líquido y coloque la placa en la platina de un microscopio estereoscópico.

Oriente la aguja justo distal al radio óseo. Inserte la aguja suavemente en el tejido regenerativo justo distal a cada radio óseo y empuje distalmente hasta que se localice en el blastema. Cuando la aguja esté correctamente localizada, siga las instrucciones del sistema de microinyección e inyecte una gota de cinco nanolitros del morpho por inyección.

Con cada inyección, se puede ver una bocanada amarilla de solución morfo, que ayuda a localizar la inyección en el blastema trabajando dorsalmente desde la línea media. Inyectar aproximadamente 75 nanolitros de morfo por radio óseo en el lado dorsal, dejando el lado ventral como único control de electroporación inmediatamente después de la inyección del morfo. Retire la placa de inyección del aparato de microinyección.

Llene bien la placa de inyección con la solución anestésica hasta que el pez quede sumergido. Para asegurarse de que los electrodos electroporados no toquen el tejido de la aleta, gire el pez sobre su lado dorsal y mire directamente hacia abajo en la línea media para la electroporación. Ajuste los parámetros de electroporación a 10 pulsos consecutivos de 50 milisegundos a 15 voltios con una pausa de un segundo entre pulsos con electrodos de pinza de placa de platino de tres milímetros de diámetro ajustados cerca pero sin tocarse.

Las aletas electroporan tanto el lado dorsal como el ventral de la aleta para evitar la acumulación de carga de las burbujas que puedan formarse. Limpie los electrodos con una toallita húmeda después de cada electroporación. Finalmente, coloque el pez en un portaobjetos de vidrio o en una placa de Petri y obtenga una imagen rápida de la aleta, asegurándose de anotar la orientación ventral dorsal.

Esta imagen se utilizará para el análisis de rebrote al día siguiente. Regrese el pez al tanque si se requiere la proteína objetivo para la regeneración adecuada de las aletas. Una diferencia dramática entre las mitades dorsal y ventral de la aleta debería ser evidente un día después de la electroporación o tres días después de la amputación.

Tome otra foto de la aleta y haga coincidir esta imagen con una imagen correspondiente de dos días después de la amputación tomada después de la electroporación. Usando la imagen de los NIH, trace las áreas de los dos días posteriores a la amputación y los tres días posteriores a la amputación de las mitades dorsal y ventral. Para determinar el porcentaje de crecimiento de la aleta dorsal frente a la ventral, utilice la siguiente fórmula.

La cantidad dorsal tres días después de la amputación menos la dorsal dos días de amputación dividida por la cantidad ventral tres días después de la amputación menos la ventral dos días después de la amputación multiplicada por 100 es igual al área porcentual. Cuando se realiza el ensayo para el crecimiento de la aleta a los tres días después de la amputación o 24 horas después de la electroporación, el morino marcado con fluoresceína debe estar presente en la mitad dorsal de la aleta. Es normal ver algunos rastros hasta el nivel de la amputación.

Cuando se inyecta un morfo de control en la mitad dorsal de la aleta 24 horas después de la electroporación, se observa un crecimiento igual al del lado ventral, como se muestra aquí. Inyectar la mitad dorsal de la aleta con un morfo experimental inhibe el rebrote en ese lado. Siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la inmunohistoquímica y la hibridación C, 2, la PCR en tiempo real y la inmunotransferencia, para responder a preguntas adicionales, como qué vías genéticas se requieren para la regeneración.