Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

El objetivo general de este procedimiento es separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Esto se logra primero preparando un gel con la concentración adecuada de aros y un colorante fluorescente. El segundo paso consiste en verter el gel en un molde apropiado y dejar que se solidifique a continuación.

Las muestras se cargan en el gel y se aplica una corriente eléctrica. El paso final consiste en visualizar los fragmentos de ADN separados bajo luz ultravioleta. En resumen, la electroforesis en gel AGROS se utiliza en todas las situaciones en las que se requiere la separación rutinaria de fragmentos de ADN.

La principal ventaja de esta técnica frente al método existente en ese momento, como la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, es que permite la visualización de bandas de ADN, y también nos permite determinar el signo exacto y el tamaño exacto del fragmento de ADN cuando se separa simultáneamente con un marcador de ADN. Este método es esencial en la investigación de ciencias de la vida, como en la clonación de genes y la purificación y secuenciación de moléculas de ADN. Aunque este método se utiliza generalmente para separar fragmentos de ADN entre cien pares de bases y 25 kilobases, también puede modificarse para separar fragmentos de ADN de hasta 10 megabases de tamaño.

Los geles de agarosa se preparan utilizando una solución porcentual peso sobre volumen. La concentración de agarosa y un gel dependerá del tamaño de los fragmentos de ADN que se vayan a separar. Para comenzar el procedimiento de elaboración de un gel, pese la masa adecuada de agarosa en un matraz erlenmeyer y agregue el volumen apropiado de tampón de electroforesis al matraz.

El volumen del tampón no debe ser mayor que un tercio de la capacidad del matraz. Agite para mezclar y derrita la mezcla de tampón aros calentando en un microondas a potencia máxima. En intervalos de 32 segundos, retire el matraz y agite el contenido para mezclar. Repita bien hasta que los agros se hayan disuelto completamente.

A continuación, agregue bromuro de atherium hasta una concentración de 0,5 microgramos por mililitro. Es importante tener en cuenta que el bromuro de atherium es un carcinógeno, por lo que siempre se deben usar guantes al manipular geles que contengan bromuro de atherium. Deje enfriar el agros mediante incubación en un baño de agua a 65 grados Celsius. La falta de hacerlo deformará la bandeja del gel mientras el aros se enfría.

Prepare el molde para geles colocando la bandeja de gel en el aparato de vertido. Alternativamente, se puede sellar con cinta los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde. Coloque un peine adecuado en el molde de gel para crear los pocillos.

Vierta el molde y los aros en el molde de gel. Deje que los aros se solidifiquen a temperatura ambiente. Una vez que los aros estén sólidos, retire el peine.

Si el gel no se va a utilizar inmediatamente, envuélvalo en una envoltura de plástico y almacénelo a cuatro grados Celsius hasta su uso. Si el gel se va a utilizar inmediatamente, coloque el gel en la cubeta para geles. Para comenzar este procedimiento, agregue colorante de carga para geles a las muestras de ADN que se van a separar.

La tinción de carga se prepara típicamente a una concentración seis veces mayor. Conecte la fuente de alimentación al voltaje deseado y agregue suficiente tampón de corrida al recipiente del gel para cubrir la superficie del gel. Es importante utilizar el mismo tampón de corrida que el empleado para preparar el gel. Conecte los cables del recipiente del gel a la fuente de alimentación y encienda la fuente de alimentación. Verifique que tanto el recipiente del gel como la fuente de alimentación estén funcionando correctamente.

La aparición de burbujas en los electrodos indica que la corriente está pasando a través de ellos. Dado que nuestras manos tienden a temblar ligeramente de forma natural, puede resultar difícil introducir una punta de pipeta pequeña en un pocillo pequeño. Una forma de evitar que nuestra mano tiemble es apoyarla sobre el otro brazo o sobre la caja de gel.

Retire la tapa de la caja de gel lentamente y con cuidado. Cargue las muestras de ADN en el gel. El colorante de carga en la muestra permite que esta se hunda en el gel y ayudará a rastrear qué distancia ha recorrido la muestra. Siempre se debe cargar un marcador de tamaño de ADN junto con las muestras experimentales.

Sustituya la tapa. Verifique cuidadosamente que los electrodos estén conectados en los orificios correctos de la fuente de alimentación. Encienda la corriente y corra el gel hasta que el colorante haya migrado una distancia apropiada.

Una vez finalizada la electroforesis, apague la fuente de alimentación y retire la tapa de la cámara de gel. Saque el gel de la cámara y elimine el exceso de tampón de la superficie del gel. Coloque la bandeja del gel sobre toallas de papel para absorber cualquier tampón de electroforesis residual.

Para visualizar los fragmentos de ADN, retire el gel de la bandeja y exponga el gel a luz ultravioleta. Esto se realiza comúnmente utilizando un sistema de documentación de geles. Las bandas de ADN deben aparecer como bandas fluorescentes de color naranja.

Tome una imagen del gel al final del experimento y deseche adecuadamente el gel y el tampón de corrida según las regulaciones de la institución. Esta figura representa un resultado típico tras la electroforesis en gel aros de productos de PCR. Tras la separación, los fragmentos de ADN resultantes aparecen como bandas bien definidas.

El patrón de ADN o escalera debe separarse en un grado que permita determinar de forma útil el tamaño de las bandas de la muestra. En este ejemplo, se separan fragmentos de ADN de 765 pares de bases, 880 pares de bases y 1022 pares de bases en un gel de AROS al 1,5 % utilizando una escalera de ADN de dos logaritmos. Al realizar el procedimiento, es importante recordar verificar nuevamente la colocación de los electrodos antes de aplicar la corriente.

Esto garantiza que las moléculas de ADN viajen en la dirección correcta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una celda de electroforesis, separar fragmentos de ADN de diferentes tamaños y obtener imágenes representativas de sus resultados. No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, gafas protectoras y bata de laboratorio, al realizar este procedimiento.