El uso de modelos animales de sepsis para evaluar nuevas terapias a base de plantas

La sepsis se refiere a un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica resultante de una infección microbiana, y puede ser simulado por una técnica quirúrgica denomina ligadura cecal y punción (CLP). Aquí se describe un método para utilizar CLP inducida modelo animal para cribar hierbas medicinales para agentes terapéuticos.

El objetivo general de este procedimiento es producir un modelo de sepsis en ratones mediante un procedimiento quirúrgico llamado ligadura y punción SQL (CLP, por sus siglas en inglés). Esto se logra haciendo primero una incisión de 1,5 a dos centímetros en la línea media en el abdomen de un ratón. A continuación, se expone y se liga el seum, luego se perfora el suero para inducir la translocación bacteriana.

Finalmente, se cierra la incisión. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran aumentos en los niveles de citocinas sistémicas y peritoneales, así como síntomas como letargo y letalidad. Lo que les voy a mostrar es que van a producir un modelo de sepsis en ratón denominado sación y punción, que es una modificación del modelo original desarrollado por el Dr. Chandry y sus colaboradores.

La principal ventaja media de este modelo es que es el modelo más relevante de sepsis. Además, es simple, está bien caracterizado y es económicamente viable, por lo que se ha utilizado ampliamente en el campo de la investigación de la sepsis y la inflamación. A modo de ejemplo, demostraremos la utilización de este modelo para evaluar el potencial terapéutico del extracto herbal en la sepsis.

Para preparar el extracto de hierbas, remoje 10 gramos de hierbas en 200 mililitros de agua a 85 grados centígrados durante una a cuatro horas para eliminar las partículas insolubles, centrifugar la fracción de agua a 3, 300 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras. A continuación, concentre aún más el filtrado utilizando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 10.000 kilodalton y girando a 5.000 G durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.

El uso de cultivos de macrófagos cribó fracciones de bajo y alto peso molecular para inhibir las actividades de los mediadores proinflamatorios tardíos, como el grupo de alta movilidad box one o el HGB one. Para comenzar primero el aislamiento de macrófagos, se administraron interperitoneales dos mililitros de un caldo de glicol al 4% TH en ratones normales después de tres días de cultivo de macrófagos peritoneales primarios, los macrófagos en DMEM suplementados con 10% de FBS, dos milimolares de glutamina y 1% de penicilina. La estreptomicina lava suavemente los macrófagos adheridos con optimum y los incuba en el mismo medio durante dos horas.

A continuación, estimulícelos con la endotoxina bacteriana lipopolisacárido o LPS 16 horas después de la estimulación. Recoja el medio acondicionado a la célula y utilícelo para llevar a cabo el Western blot. Para medir los niveles de HM GB uno.

Cuantificar la intensidad de la banda utilizando una curva estándar generada con H mgb uno purificado para establecer la sepsis después de anestesiar a un ratón con una inyección intramuscular de 75 miligramos por kilogramo de ketamina y 20 miligramos por kilogramo de xilacina. Y mediante un pellizco en el dedo del pie para comprobar su nivel de sedación. Coloque el ratón en posición supina, limpie el abdomen y luego haga una incisión de 15 milímetros en la línea media para exponer el ciego aproximadamente a cinco milímetros de la punta de la secuela con una sutura de seda de cuatro milímetros.

Ligue el ciego y luego, con una aguja de calibre 22, punción el muñón ligado una vez para permitir la extrusión de las heces, devuelva inmediatamente el ciego a su posición intraabdominal normal y cierre el abdomen. Después de que los animales recuperan la conciencia y la movilidad. Regrese la jaula a la habitación del animal a las 24 horas.

Post CLP intraperitoneal: administrar 200 microlitros de extracto herbal o control diariamente durante tres días. Monitorizar la supervivencia del animal durante el tiempo que sea necesario a las pocas horas de la ligadura y punción por secuencia, o de la cirugía CLP. Los animales muestran signos clínicos de sepsis que incluyen piloerección, letargo, apiñamiento y disminución de la ingesta de alimentos y agua.

Los animales que desarrollan peritonitis grave con infección sistémica consecutiva normalmente mueren en un plazo de 48 a 96 horas. Sin embargo, incluso los animales que coinciden con la edad, el sexo y los antecedentes genéticos pueden responder a la cirugía de manera distinguible en el curso de la sepsis experimental, por ejemplo, a las 48 horas después de la CLP. Mientras que algunos animales pueden haberse acercado al estado de montículo como se define aquí, otros pueden permanecer en un estado no moribundo.

Los estudios exhaustivos de las citocinas circulantes revelaron diferencias dramáticas en los niveles de varias citocinas, incluidas IL seis, kc, MIP dos y ST nfr, una entre ratones en los estados moribundos y no moribundos. En particular, estos mediadores inflamatorios se han clasificado como marcadores sustitutos de sepsis porque sus niveles circulantes son predictores confiables de resultados letales en la sepsis experimental o clínica. Además, la CLP indujo la liberación local de varias citocinas y quimiocinas pro y antiinflamatorias, por ejemplo, a las 48 horas después de la CLP, todavía se pueden medir cantidades significativas de la citocina IL seis y las quimiocinas KC y MI P 2 no solo sistémicamente en la sangre, sino también localmente en el líquido de lavado peritoneal.

Aquí, se evaluaron las capacidades de varios extractos de hierbas o compuestos de control para inhibir la liberación de HGB inducida por endotoxinas. Aquellos que tenían la capacidad de inhibir la liberación de HGB se probaron in vivo utilizando un modelo de sepsis en ratones. Debido a la cinética tardía y prolongada de la acumulación de HGB one en la sepsis experimental, la primera dosis de inhibidores de HGB one se administró 24 horas después del inicio de la sepsis, un momento en el que los ratones desarrollaron signos claros de sepsis, incluyendo letargo, diarrea y piloerección, como se muestra aquí, la administración retrasada y repetida de un componente principal de la T verde epi Gallo, catequina tres GALLATE o EGCG a partir de las 24 horas después del inicio de la sepsis, rescató significativamente a los ratones de la sepsis letal incluso cuando se administró por vía oral. El EGCG aún rescató a los ratones de la sepsis letal, aumentando significativamente las tasas de supervivencia de los animales del 16% al 44%. Una vez dominada esta ligadura, el modelo de punción se puede terminar en menos de cinco minutos si se realiza correctamente.