Name: La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a infectar larvas de pez cebra con Candida albicans mediante microinyección en el ventrículo cerebral posterior. Este método permite la imagen no invasiva de interacciones huésped-patógeno en tiempo real.

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Los autores desean agradecer al laboratorio de la Dra. Carol Kim para la formación de microinyección, Clarissa Henry para el asesoramiento relativo a la aceleración el desarrollo del embrión y el uso de los equipos, y Nathan Lawson para contribuir FLI1: peces EGFP. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Wheeler y Shawn Paredes para la lectura crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer a Mark Nilan para el cuidado de los peces y el asesoramiento, y Ryan Phennicie y Gabor Cristina de asesoramiento técnico sobre este proyecto. Este trabajo fue financiado por una ayudantía de investigación MAFES a los hermanos K., MAFES Hatch subvención E08913-08, y un premio de los NIH CNRR P20RR016463 a R. Wheeler.

Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron bajo Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) de protocolo A2009-11-01. 1. Morfolino y platos de larvas de inyección Experimental Duración: * (10-15 minutos) Grado de dificultad: * <ol><li> Para inyecciones de huevo, preparar una solución al 2% de agarosa en agua estéril y microondas. Cuando la solución se haya enfriado vierta un poco de ella en un plato extra profunda Petri (Fisher Scientific) hasta que esté medio lleno. Enfriar en hielo y hacer que la placa esté nivelada. </li><li> Una vez que el plato se ha enfriado, se vierte una capa de 15 ml superior de agarosa al 2%. Rocíe una inyección de huevo molde de plástico acanalado (Adaptive herramientas de la ciencia) con agua estéril con una botella de spray. Coloque con cuidado el lado de la ranura hacia abajo en el molde caliente de agarosa. Cuando la agarosa se haya enfriado, utilizar una espátula de metal plana (VWR Scientific) para disociar el molde de la AGAse levantó. Poco a poco quitar la rejilla de la agarosa. Envuelva los platos de inyección de embriones en Parafilm (VWR Scientific) y la tienda invertida a 4 ° C. </li><li> Para las inyecciones de larvas de peces, preparar una solución al 2% de agarosa como se ha descrito. Vierta la solución en un tamaño estándar de placa de Petri (VWR Scientific) y dejar de lado hasta que solidifique. Envuelva los platos de las larvas de inyección de Parafilm y la tienda invertida a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparación de cultivo de hongos Experimental duración: ** (30 minutos) Grado de dificultad: ** <ol><li> Preparar extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) placas de agar: 10 g / litro de extracto de levadura, 20 g / litro de peptona, 20 dextrosa g / litro, y 20 g / litro de agar en y autoclave. Para líquido YPD preparar 10 g / litro de extracto de levadura, peptona 20 g / litro, 20 dextrosa g / litro y 20-30 minutos autoclave a 121 ° C. </li><li> Dos días antes de las infecciones de preparar un plato de pescado de la racha de congeladosexistencias de Candida albicans culturas en agar YPD para obtener colonias aisladas. </li><li> Incubar a 37 ° C durante la noche. </li><li> Poner 5 ml de caldo de YPD a 16 x 150 mm tubos de cultivo (VWR Scientific). </li><li> El día antes de las infecciones de pescado tomar una pequeña colonia en el agar YPD con una clavija de madera (VWR Scientific). Poner el palo en el tubo de la cultura y la forma de remolino en torno a una nueva suspensión de colonias en el líquido YPD. </li><li> Crecer durante la noche a 37 ° C en un tambor de rodillo Cultura TC-7 tejido equipado con una rueda de prueba de 14 pulgadas tubo (New Brunswick Scientific). </li><li> Al día siguiente, la desaceleración de 1 ml de la cultura en g 14000x durante 1 minuto en un tubo de 1,7 mL (Axygen). Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en el líquido residual con el vórtex (VWR Scientific). </li><li> Añadir 1 ml 1x Tampón fosfato salino (VWR Scientific) y girar como se describió anteriormente. </li><li> Repetir el lavado con PBS 3 veces. </li><li> Diluir dilución 1:100 en PBS 1x (10 l de lavado C. albicans en 990 l P 1xBS). </li><li> Cuente con un hemocitómetro (VWR Scientific). </li><li> Diluir a 10 7 células / ml. </li></ol> 3. Infecciones de pez cebra Experimental Duración: **** (1-3 horas) Grado de dificultad: **** <ol><li> Recoge los embriones de acuerdo a la sección 5 y la tienda en la yema de agua, 60 mg / L de sales de mar instantáneos (Fisher Scientific) en agua desionizada estéril. </li><li> Utilizando un microscopio de disección, tales como la SZ61 Olympus (Olympus), embriones dechorionate en día infección. Use unas pinzas Dumont Dumoxel (VWR Scientific) para sacar el corion 27 pedazos como la apertura de una bolsa de papas fritas, o suavemente la pinza en la posición cerrada en el corion y luego poco a poco a abrir. El pescado debe estallar a la derecha del corion. </li><li> Agitar el plato Petri adicional de profundidad con la tapa en mover el pescado en el centro del plato. Transferir los peces a la tapa de la cápsula. Quitar huevo-agua y sereemplazar con medio fresco. Añada el pescado a los medios. </li><li> Caliente los platos de inyección de larvas en una incubadora a 28 ° C. Preparar tricaína metano sulfonato (Occidental Chemical Inc.) la dilución a 200 mg / ml para anestesiar a los peces. </li><li> Contar el número deseado de las larvas de la infección (20-50 pescado). Coloque el pescado en una solución tricaína metano sulfonato y esperar 1-2 minutos hasta que deja de moverse. </li><li> Encienda la unidad MPPI-3 de la inyección (Applied Scientific Instruments). Asegúrese de que el interruptor de presión es el &quot;pulso&quot; y la &quot;duración de impulso&quot; se ajusta a 9 con 3 PSI para la unidad de contrapresión. Abrir la válvula al tanque de nitrógeno hasta que la presión en la unidad de inyección lee 30 PSI. </li><li> Cargar una tira micropipeta 28 con 5 l de vórtex Candida albicans a una concentración de 1x10 7 células / ml. Colocar la micropipeta en el titular de la micropipeta (Applied Scientific Instruments). Llenar un vacío plato extra de Petri con agua profunda. Mueva la micropipeta hasta que la punta is dentro de vista simplemente tocando la superficie del agua a través de microscopio de disección y el uso Dumont Dumoxel pinzas (VWR Scientific) para recortar la aguja aproximadamente 3 mm desde la punta de la pipeta sacó. </li><li> Pulse el interruptor de pie (Applied Scientific Instruments) para verificar que la aguja ha sido recortada. Usted debe ver el líquido se dispersan si tuvieron éxito. El diámetro del bolo líquido no debe ser más grande que el diámetro de la pupila de la larva de pez cebra prim 25 (0,21 mm, dando una esfera de 4,9 nL en volumen). Ajustar la presión de acuerdo a si el bolo de líquido es demasiado grande o demasiado pequeño. </li><li> Se anestesia a los peces en metano sulfonato tricaína (200 ug / ml). Una vez que los peces han dejado de moverse, girar el plato con la tapa puesta hasta que el pescado se encuentran en el centro. Recoge el 50 peces utilizando una pipeta de transferencia (Fisher Scientific). Toque en el lado de la pipeta para liquidar a los peces hacia la punta. Suavemente pipetear pescado en el plato de larvas de agarosa utilizando como líquido poco como sea posible. </li><li> Cubra el pescado con una varilla de vidrio liso (tenga cuidado de no aplastarlos!). Aspirar el líquido que sea posible, fuera del plato. Use un KIMWIPE que absorbe y expulsa a la basura cualquier humedad. </li><li> Coloque el plato de larvas de peces de agarosa bajo el microscopio hasta que obtener una buena vista de los peces y la aguja, al mismo tiempo. Mueva la aguja de cristal hacia el pez. Zoom sobre los peces y la aguja a medida que la posición de la aguja hacia el pez. Cuidadosamente mueva la aguja de vidrio en la vesícula ótica 27, 29 (del oído) de los primeros peces. Usted sabrá una vez que haya movido la aguja en el pescado, porque cuando se presiona el interruptor de pie (Applied Scientific Instruments), el ventrículo cerebro posterior se levante un poco. </li><li> Pulse el interruptor de pie (Applied Scientific Instruments) y ver que el líquido se dispersan en el interior posterior del cerebro de los peces del ventrículo 27. Retirar la aguja de los peces y los peces se mueven a la siguiente. Repita el procedimiento hasta que se ha inyectado todo el pescado en el plato. Retire cualquier dead peces e inyectar reemplazos para mantener el número correcto (50 peces). Para cada grupo de 50 peces inyecta una aguja de microinyección nueva debe estar preparado, o C, el albicans se asienta en la parte inferior de la aguja y obstruye, o lanza de la concentración inyectada. </li><li> Lave el pescado fuera del plato se coloca la fuente y rociar agua sobre los huevos de los peces en un recipiente limpio plato extra profunda de Petri que contiene 60 ml de huevo y agua. Es importante no dejar el pescado en la agarosa durante más de 15-20 minutos o se sequen y mueran. </li><li> Repita todo el proceso de inyección hasta que termine. No te olvides de PBS y no patógenas controles inyectados. </li><li> Cuando haya terminado, mantener el pescado a 28 ° C. </li><li> Cierre la válvula del tanque de nitrógeno. Mueva el interruptor de la unidad de inyección de &quot;pulso&quot; a la &quot;continua&quot; para aliviar la presión en el conducto del tanque, la presión debe caer a cero en este punto. Cambiar la unidad de inyección de nuevo a &quot;pulso&quot;. Apague la unidad de inyección y limpiar el área de trabajo. </li></ol&gt; 4. Preparación del pescado de la Imagen Experimental duración: ** (30 minutos) Grado de dificultad: ** <ol><li> Preparar metano sulfonato tricaína solución como antes (200 mg / mL). ¡Fuera los peces infectados, y transferirlos a tricaína. </li><li> Preparar 47,9 ml 0,4% de agarosa de bajo punto de fusión (VWR Scientific) en el huevo y agua. Calentar la solución en el microondas. Enfriar a 37 ° C y añadir metano sulfonato tricaína (200 mg / mL) a la mezcla de </li><li> Una vez que los peces se inmovilizan en metano sulfonato tricaína, pescado pipeta individual en una placa de Petri (VWR Scientific) que contenía 0,4% de agarosa de baja fusión (VWR Scientific). </li><li> A continuación, desplace el pescado de agarosa de bajo masa fundida en pocillos individuales de una placa de fondo de cristal (MatTek Corporation) para la imagen. El uso tan poco agarosa de bajo fundido como sea posible para los peces descansa plana sobre la parte inferior de la cápsula. Sólo utilizar suficiente de la tricaína-agarosa para llenar el enner los círculos del plato con fondo de cristal. </li></ol> 5. Modificaciones relacionadas con Júpiter Protocolos Micropipetas para la microinyección Experimental Duración: * (10-15 minutos) Grado de dificultad: * <ol><li> Tire de las barras huecas de vidrio BF120-69-10 (Sutter Instruments) con un extractor de Flaming Brown Micropipeta Modelo P-97 (Sutter Instruments) de acuerdo con Yuan et al. 30. Elija el programa # 7 con el calor las condiciones siguientes = 470, Velocidad = 120, Tiempo = 200. La aguja resultante es de 8 mm de bisel a la punta y, una vez cortado a 3 mm por encima de la punta tiene un diámetro de aproximadamente 10 micras. </li><li> Cargar una micropipeta de vidrio en los soportes. Seleccione &quot;Pull&quot;. El filamento de calentamiento se calienta la aguja de acuerdo con los parámetros del programa y la varilla de vidrio se separan en dos micropipetas tirados. Micropipetas guardarla en una caja de almacenamiento de la pipeta (Sutter instrumentos). </li></ol> Recogida de embriones, inyección Morpholino y mantenimiento Experimental Duración: *** (1-2 horas) Grado de dificultad: *** <ol start="3"><li> Recoger embriones de acuerdo con los métodos de Rosen et al. 31. Use un colador de plástico (Mercancías de Knutsford) para recoger huevos de el tanque de desove (hábitats acuáticos). Sostenga el tamiz boca abajo sobre una placa de Petri de profundidad extra y enjuague con agua el tanque para recoger los huevos. </li><li> Para la preparación de morfolino, añadir 300 l de agua estéril a 300 nanomoles de morfolino (GeneTools, LLC). Esto da un stock de trabajo de 1,0 mM. </li><li> Comprobar la concentración de la morfolino mediante un Nanodrop (Thermo Scientific). Seleccione &quot;ácido nucleico y cambiar el tipo de muestra a&quot; otros &quot;y longitud de onda a 265. Introducir la constante multiplicando el peso molecular del morfolino por 1000 dividido por el absorptivitcoeficiente y que figuran en la hoja de propiedades morpholino oligo. </li><li> En blanco el NanoDrop con 2 l de HCl 0,1 N. Diluir 5 l de la solución morfolino en 95 l de HCl 0,1 N (20x dilución). Coloque 2 l de la dilución en el pedestal y la medida nanodrop clic. Multiplicar la concentración por el factor de dilución (20). Esto da una concentración de trabajo de morfolino. Para calcular la concentración milimolar dividir la concentración obtenida por el peso molecular del morfolino. </li><li> Preparar un stock de trabajo de morfolino en Danieau tampón (58 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,4 mM de MgSO 4, 0,6 mM de Ca (NO 3) 2, 5,0 mM de HEPES, pH 7,6) y 0,01% de rojo fenol (VWR Scientific). </li><li> Para el trabajo de inyección morfolino seguir el protocolo de acuerdo con Rosen et al. 31 y Yuan y col. 30. Enjuague los platos con huevo morpholino de inyección de agua y caliente a 28 ° C durante 15 minutos. Elimine el agua de los platos de inyección y un line-up-cembriones ell etapa en las ranuras del plato de inyección (preparado a partir de la sección 1) con una pipeta de transferencia. Cada placa tiene capacidad para aproximadamente 250 huevos. Inyectar 1-2 embriones en estado de celulares con morfolino. Los huevos se mantendrán en la etapa uno de células durante 15 minutos 27. </li><li> Lavar los huevos inyectados con huevo de agua cuando haya terminado (de agua desionizada estéril con 60 mg / L de sales de Instant Ocean) y colocarlo en 60 ml de huevos de agua en los platos de Petri de profundidad. Platos Morpholino de inyección pueden ser reutilizados. Enjuague con agua de huevo cuando haya terminado y almacenar invertido a 4 ° C. </li><li> Para el almacenamiento de embriones Añadir 60 ml de agua de huevos al plato. Contar en 110 embriones con una pipeta de transferencia en una cápsula de Petri adicionales de profundidad con 60 ml de huevo y agua. Añadir 0,00003% de azul de metileno para prevenir el crecimiento microbiano y los embriones se incuban a 28 ° C. </li><li> Para acelerar el desarrollo de los embriones de mantener los platos de embriones a los 33 ° C durante 24 horas y la etapa de acuerdo a Kimmel et al. 27, que permite el desarrollo de los embriones a un punto críticotronco ángulo de 75 ° (25 Prim etapa 27). </li><li> Para el trabajo de la infección por larvas de mantener a los embriones a 28 ° C después de la inyección con C. albicans. </li><li> Cada día reemplazar a los platos de embriones con 60 ml de agua fresca de huevo. </li></ol> Imágenes Experimental Duración: ***** (1-5 horas) Grado de dificultad: *** <ol start="14"><li> Preparar los peces en agarosa de bajo derretimiento (de acuerdo con la sección 4.2) con tricaína en platos de cristal de imagen de fondo (MatTek Corporation) como se describió anteriormente. Coloque el plato en una Olympus IX-81 (Olympus) platina del microscopio invertido. Traiga a los peces en el foco bajo magnificación de 4x con contraste de interferencia diferencial (DIC) de luz. Las imágenes pueden capturarse a 20x 4x, y 40x en la DIC, TRITC (isotiocianato de tetrametil rodamina) y FITC (isotiocianato de fluoresceína) la configuración del filtro. </li><li> Utilice una Olympus IX-81 microscopio invertido con un FV-1000 barrido láser confocal de sistema de acuerdo con Ariga et al. 32. Llevar a cabo cursos de tiempo con un aumento de 40x mediante el establecimiento de Z-series con rodajas de 1-1,5 micras cada hora de la infección. </li><li> Para imágenes de larga evolución en el tiempo de 2 horas o más, coloque una capa de agarosa de baja fusión en la parte superior del pescado en el plato de imagen cada 2-3 horas. Esto evita que la agarosa de la desecación y trituración de los peces mientras se va a examinar. Para los cursos de tiempo prolongados con un pequeño número de peces, utilice una etapa calentada (Bioptechs Inc.) para mantener 28 ° C durante las infecciones. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de un éxito rombencéfalo ventrículo C. albicans en una larva de pez cebra en 5 horas después de la infección-(HPI) y HPI 24 se muestra en (Figura 1). Como los macrófagos-células con envolvió C. albicans se ven en el ventrículo posterior del cerebro a las 5 hpi. Al 24 hpi, C. albicans se encuentra dentro de los macrófagos-célulass en el tejido dorsal de la cola indicativo de candidiasis diseminada. Este resultado infección es altamente dependiente de una inyección precisa de 10-15 levadura forma C. albicans en el ventrículo posterior del cerebro. Proyección de los peces infectados inmediatamente después de la inyección puede asegurar esto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4051/4051fig1.jpg" /> Figura 1 FLI1 transgénico:. EGFP 22, 33 larvas infectadas con CaF2-yCherry Candida albicans y la imagen intravitally por microscopía confocal. (CA) 5 horas después de la infección-(A) larva infectada con EGFP-expresión de los macrófagos-células en el sitio de la infección (rombencéfalo ventrículo) Barra de escala = 100 micras. (B y C) Las imágenes de mayor ampliación de los mismos peces, mostrando C. albicans, dentro de los fagocitos. Barra de escala = 100 m para B y 10 micras de C. (DF) 24 horas después de la infección (D) larva infectada con candidiasis diseminada con CaF2-yCherry C. albicans en el interior EGFP macrophage-como las células en el tejido dorsal de la cola. Barras de escala = 100 micras. (E y F) Las imágenes de mayor ampliación de los mismos peces, mostrando C. albicans en el tejido de la cola. Barras de escala = 100 micras.

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<li>Levraud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+listeria+monocytogenes-phagocyte+interactions+in+living+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae.</a> Infect. Immun. 77, 3651-3660 (2009).</li>
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<li>Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vertebrate+model+of+Staphylococcus+aureus+infection+reveals+phagocyte-dependent+resistance+of+zebrafish+to+non-host+specialized+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens.</a> Cell Microbiol. 10, 2312-2325 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de la microinyección de pez cebra que aquí se presenta se diferencia de Gutzman et al. 34 en que aquí se demuestra la inyección a través de la vesícula ótica en el ventrículo posterior del cerebro de 36 a 48 larvas de HPF. El método que permite describir para inyección consistente de 10-15 levadura en el ventrículo rombencéfalo con daño tisular reducida. Este protocolo produce una infección local que inicialmente se extiende por todo el cuerpo en un 24 hpi (Figura 1) y los ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Los tanques de desove </td><td> Los hábitats acuáticos </td><td> 2L </td><td></td></tr><tr><td> 1,7 ml tubos </td><td> Axygen </td><td> MCT-175-C </td><td></td></tr><tr><td> Instant Ocean </td><td> Fisher Scientific </td><td> S17957C </td><td></td></tr><tr><td> Adicionales de profundidad placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 a 757-11Z </td><td></td></tr><tr><td> Standard placas de Petri </td><td> VWR Scientific </td><td> 25384-302 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas de transferencia </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-7M </td><td></td></tr><tr><td> Extracto de levadura </td><td> VWR ScientiFIC </td><td> 90000-726 </td><td></td></tr><tr><td> Peptona </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-264 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrosa </td><td> Fisher Scientific </td><td> D16-1 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> VWR Scientific </td><td> 90000-760 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro desechable </td><td> VWR Scientific </td><td> 82030-468 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón fosfato salino </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-986 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Dumoxel Pinzas </td><td> VWR Scientific </td><td> 100501-806 </td><td></td></tr><tr><td> Clavijas de madera </td><td> VWR Scientific </td><td> 10805-018 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR Scientific </td><td> 300053-964 </td><td></td></tr><tr><td> Bajo DerretirAgarosa </td><td> VWR Scientific </td><td> 12001-722 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa para los platos de inyección </td><td> VWR Scientific </td><td> 12002-102 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming Brown Micropipeta Extractor </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Varillas de vidrio huecas </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td> Para varillas de vidrio de cristal liso por calentamiento sobre mechero de Bunsen </td></tr><tr><td> Caja de almacenaje con una pipeta </td><td> Sutter Instruments </td><td> BX10 </td><td></td></tr><tr><td> MPPI-3 Sistema de inyección </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> MPPI-3 </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de presión de retorno </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> BPU </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta kit de soporte para </td><td> Aplicacionesed Instrumentación Científica </td><td> MPIP </td><td></td></tr><tr><td> Interruptor de pie </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> FSW </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> MM33 </td><td></td></tr><tr><td> Base magnética </td><td> Instrumentación Científica Aplicada </td><td> Base magnética </td><td></td></tr><tr><td> Tricaína metano sulfonato </td><td> Occidental Chemical Inc. </td><td> MS-222 </td><td></td></tr><tr><td> La disección de Alcance </td><td> Olimpo </td><td> SZ61 arriba SZX-ILLB2-100 de base </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Confocal </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 con FV-1000 Sistema láser confocal de barrido </td><td></td></tr><tr><td> TC-7 Cultivo de Tejidos de rodillos de tambor de la rueda con 14 pulgadas de tubo de ensayo </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> TC-7 </td><td></td></tr><tr><td> Platos de imagen </td><td> MatTek Corporación </td><td> P24G-1.0-10-F </td><td></td></tr><tr><td> Puntas de pipeta para la carga de agujas </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de vertido redes </td><td> De adaptación de la ciencia Herramientas </td><td> TU-1 </td><td></td></tr><tr><td> Etapa climatizada </td><td> Bioptechs Inc. </td><td> Delta T-5 </td><td></td></tr><tr><td> Espátula plana </td><td> VWR Scientific </td><td> 82027-486 </td><td></td></tr><tr><td> Los tamices de plástico </td><td> Mercancías de Knutsford en línea </td><td> 12 cm </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR Scientific </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td> VWR Scientific </td><td> 14216-184 </td><td></td></tr><tr><td> 16 x 150 mm tubos de Cultura </td><td> VWR Scientific </td><td> 60825-435 </td><td></td></tr><tr><td> Nanodrop </td><td> Thermo Scientific </td><td> ND 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Rojo fenol </td><td> VWR Scientific </td><td> 97062-478 </td><td></td></tr><tr><td> De HCl </td><td> VWR Scientific </td><td> 87003-216 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4534-500GP </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4532-500GP </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0246-500GP </td><td></td></tr><tr><td> Ca (NO 3) 2 </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH0226-500GP </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> VWR Scientific </td><td> BDH4520-500GP </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Morpholinos </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

La candidiasis diseminada causada por el patógeno Candida albicans es un problema clínicamente importante en individuos hospitalizados y se asocia con una mortalidad de 30 a 40% atribuible 6. La candidiasis sistémica es normalmente controlada por la inmunidad innata, y las personas con defectos genéticos en los componentes de células inmunes innatas como la NADPH oxidasa fagocítica son más susceptibles a la candidemia 7-9. Muy poco se sabe sobre la dinámica de la C. la interacción albicans con las células inmunes in vivo. extensa en estudios in vitro han demostrado que fuera del huésped C. albicans, germina en el interior de los macrófagos, y es rápidamente destruido por los neutrófilos 10-14. Los estudios in vitro, aunque útil, no se puede resumir el complejo en un entorno vivo, que incluye el tiempo que dependen de la dinámica de los niveles de citoquinas, archivos adjuntos de la matriz extracelular, y los contactos intercelulares 10, 15-18 </sup&gt;. Para investigar la contribución de estos factores en la interacción huésped-patógeno, es fundamental para encontrar un organismo modelo para visualizar estos aspectos de la infección de forma no invasiva en un huésped vivo intacta. La larva de pez cebra ofrece un hospedador vertebrado único y versátil para el estudio de la infección. Durante los primeros 30 días de desarrollo de larvas de pez cebra sólo tienen defensas inmunológicas innatas 2, 19-21, lo que simplifica el estudio de enfermedades como la candidiasis diseminada que son altamente dependientes de la inmunidad innata. El pequeño tamaño y la transparencia de las larvas de pez cebra permitirá imagen de la dinámica de la infección a nivel celular, tanto para hospedante y el patógeno. Larvas transgénico con fluorescencia células inmunes puede utilizarse para identificar los tipos de células específicos implicados en la infección 22-24. Modificados oligonucleótidos antisentido (Morpholinos) se puede utilizar para derribar varios componentes inmunes como la NADPH oxidasa fagocítica y estudiar los cambios en respuesta a fungal infección 5. Además de las ventajas prácticas y éticas de la utilización de un pequeño vertebrado inferior, las larvas de pez cebra ofrece la posibilidad única de la imagen de la batalla campal entre patógeno y huésped tanto intravitally y en color. El pez cebra se ha utilizado para la infección de modelo para una serie de bacterias patógenas humanas, y ha sido instrumental en importantes avances en nuestra comprensión de la infección por micobacterias 3, 25. Sin embargo, sólo recientemente han patógenos mucho más grandes tales como hongos han utilizado para infectar larva 5, 23, 26, y hasta la fecha no ha habido una descripción visual detallada de la metodología de la infección. Aquí les presentamos nuestras técnicas de microinyección cerebro posterior del ventrículo de Prim 25 el pez cebra, incluyendo nuestras modificaciones de los protocolos anteriores. Nuestros resultados con el modelo de larvas de pez cebra para la infección por hongos difieren de los estudios in vitro y refuerzan la necesidad de examinar la intera huésped-patógenocción en el complejo entorno de la máquina en lugar del sistema simplificado de la placa de Petri 5.

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la infección<sup&gt; 1-4</sup&gt;. Aquí nos demuestran técnicas para infectar larvas de pez cebra con el hongo patógeno<em&gt; Candida albicans</em&gt; Por microinyección, la metodología usada recientemente para implicar a la actividad de los fagocitos de la NADPH oxidasa en el control del dimorfismo de hongos<sup&gt; 5</sup&gt;.

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

La candidiasis diseminada causada por el patógeno Candida albicans es un problema clínicamente importante en personas hospitalizadas y se asocia con un 30...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar técnicas para infectar larvas de pez cebra utilizando el patógeno fúngico Candida albicans. Primero, se prepara un cultivo fúngico fluorescente y se recubren los embriones de pez. A continuación, los peces se alinean en un plato de inyección AROS.Candida albicans se microinyecta a través del oído de cada pez en el ventrículo hindbrain, luego se incluye en agarosa de bajo punto de fusión y se visualiza mediante microscopía de epifluorescencia. En definitiva, este método puede utilizarse para obtener imágenes no invasivas de la interacción huésped-patógeno en el entorno complejo del huésped, en lugar de en el sistema simplificado de la placa de Petri. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inyección en la vena caudal es que permite crear una infección localizada que da lugar a una enfermedad diseminada letal.Además, esta técnica permite la inyección eficiente de las células inherentemente grandes de C. buccan en larvas pequeñas de pez cebra. Comience por rayar un cultivo de Candida albicans en una placa de agar de dextrosa para levaduras. Incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius para permitir el crecimiento de colonias.Una vez que las colonias sean visibles, utilice un palillo de madera estéril para seleccionar una colonia aislada y disolver la levadura en cinco mililitros de caldo fresco de extracto de levadura con peptona y dextrosa en tubos de cultivo de 16 por 150 milímetros. Coloque el cultivo en un tambor rotatorio para cultivo de tejidos, equipado con una rueda para tubos de ensayo, e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo cónico de 1,5 mililitros y centrifugue a 14.000 ×g durante un minuto para obtener un sedimento celular; luego deseche el sobrenadante y agite el sedimento mediante vortex para desalojarlo.Re_suspenda las células en un mililitro de PBS, vortexee y centrifugue nuevamente. Luego deseche el sobrenadante y repita este lavado. Repita el paso tres veces para eliminar cualquier medio de cultivo residual.Una vez que se hayan lavado las células, cuéntelas en un hemocitómetro con una dilución de uno a 100 en PBS. Para un cultivo de 12 horas, se espera de tres a cuatro veces 10 a la ocho células por mililitro. Reese's ajusta la levadura a una concentración final de 10 a la siete células por mililitro.Utilice un tamiz para recolectar embriones de pez cebra de un tanque de desove el día anterior a la inyección y almacénelos en una solución de agua para huevos que contenga 60 miligramos por mililitro de sales de mar instantáneo en agua desionizada estéril. Luego, coloque los embriones a 33 grados SIUs durante 24 horas con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Esto permite el desarrollo del embrión hasta la etapa larval prim 25, la etapa óptima para la infección el día de la infección.Transfiera los embriones con una pipeta de transferencia a 60 mililitros de agua de huevo en una placa de Petri profunda adicional. Luego, utilice un microscopio estereoscópico y pinzas Dumont para despojar a los embriones. Esto puede lograrse tirando suavemente de la corion como si fuera una bolsa de papas fritas hasta que el pez salga.Una vez que todos los embriones hayan sido desprovistos de sus cubiertas, gire la placa de Petri para mover los peces hacia el centro, transfiéralos a la tapa del recipiente, retire el medio y sustitúyalo por agua fresca para huevos. Añada los peces al agua fresca para huevos.Prepare una solución de 200 microgramos por mililitro de trica metano sulfonato para anestesiar los peces utilizando una pipeta de transferencia. Recolecte entre 20 y 50 embriones y colóquelos en la solución anestésica durante uno o dos minutos, o hasta que dejen de moverse. Mientras tanto, encienda la unidad de inyección, asegurándose de que la presión se active en pulso y de que la duración del pulso esté ajustada a nueve con tres PSI para la unidad de presión de retroceso.Abra gradualmente la válvula del tanque de nitrógeno hasta que la presión de inyección alcance 30 PSI. A continuación, cargue la micropipeta agrupada con cinco microlitros de solución de *Candida albicans* en vórtice y colóquela en el soporte de micropipeta. Coloque una placa de Petri extra profunda que contenga agua sobre el portaobjetos del microscopio estereoscópico y ajuste la posición de la micropipeta hasta que quede en el campo de visión y su extremo esté parcialmente sumergido en el agua.Luego, utilizando pinzas, corte la aguja de la pipeta agrupada aproximadamente tres milímetros desde la punta. Si la aguja se ha cortado correctamente, al presionar el interruptor de pedal de la unidad de inyección debería permitir la dispensación del líquido. Utilizando una placa graduada, mida el volumen dispensado y luego ajuste la presión para que el volumen de líquido dispensado tenga un diámetro de 0,21 milímetros o ligeramente inferior al tamaño de la pupila de un embrión de pez cebra.Una vez que el microscopio esté configurado y los peces estén anestesiados, agregue líquido al platillo para hacer que los peces se desplacen hacia el centro y recójalos con una pipeta de transferencia. Toque suavemente el costado de la pipeta para que los peces se asienten en la punta. Luego, utilizando el menor volumen posible, deposite cuidadosamente los peces sobre un platillo de inyección para larvas precalentado a 28 grados Celsius.Utilizando una varilla de vidrio lisa, alinee cuidadosamente el pescado. Luego, con una toalla de papel, retire tanto líquido como sea posible del recipiente. Coloque el recipiente con el pescado bajo el microscopio hasta que tanto la aguja como el primer ejemplar estén claramente visibles.Asegúrese de que cada pez siga vivo observando la presencia de un latido cardíaco visible. Si está muerto, deséchelo y continúe con el siguiente. Mueva la aguja de vidrio hacia el pez acercando la imagen.Mientras lo hace, inserte cuidadosamente la aguja en la estructura circular del oído del pez, que contiene dos otolitos ubicados justo detrás del ojo. Una vez que la aguja esté en posición, inyecte la levadura utilizando el interruptor de pedal. Si la aguja se ha insertado correctamente, el ventrículo del cerebro posterior del pez se hinchará ligeramente tras la inyección; retire entonces la aguja y repita el procedimiento con el siguiente pez.Todo el proceso no debe durar más de 15 o 20 minutos, ya que los peces se desecarían y morirían después de este tiempo. Además, la levadura también se sedimentará en el fondo de la micropipeta y provocará una infección desigual, dosis inconsistentes o una obstrucción de la micropipeta colectiva. Una vez que todos los peces hayan sido inyectados, utilice agua de huevo para enjuagarlos desde los aros y transferirlos a una placa de Petri nueva que contenga 60 mililitros de agua de huevo.Luego coloque el recipiente a 28 grados Celsius. Cierre la válvula de nitrógeno y coloque el interruptor de inyección en continuo para aliviar la presión en la línea del tanque. A continuación, cuando la presión descienda a cero, regrese el interruptor a pulso y apague la unidad de inyección.Comience por anestesiar el pez infectado en sulfato de trica metano tal como se describió anteriormente. Una vez que los peces estén anestesiados, utilice una pipeta para transferir un pez a la vez a una placa de Petri que contenga agar al 0,4 % de bajo punto de fusión. Luego, utilizando una pipeta de transferencia y llevando la menor cantidad posible de agaros.Transfiera cada pez desde la placa de Petri a un pocillo de un plato de vidrio para imágenes con fondo de vidrio, con aproximadamente 0,2 mililitros y 0,4 % de agarosa de fusión baja suplementada con 200 microgramos por mililitro de anestésico sobre el pez, de modo que los círculos internos se llenen y una capa delgada de agarosa se extienda por el fondo del pocillo. Ahora se puede observar al pez durante hasta 24 horas utilizando un microscopio invertido con sistema de escaneo láser confocal. Cinco horas después de infectar a los peces cebra con Candida albicans fluorescente roja.La levadura es visible en el cerebro posterior del pez en FL I un pez EGFP, como estos, el endotelio vascular y células similares a macrófagos en todo el cuerpo del pez son fluorescentes. Se muestran aquí en verde, cinco horas después de la infección. La levadura puede observarse dentro de células similares a macrófagos a las 24 horas.La infección se ha diseminado a lo largo del tejido dorsal de la cola, donde nuevamente se puede detectar la levadura dentro de las células FTIC. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar microinyecciones de Candida albicans en el ventrículo del cerebelo de larvas de pez cebra en estadio Prim 25, incluyendo: uno, preparar el cultivo fúngico; dos, anestesiar las larvas de pez cebra; y tres, realizar la microinyección en el ventrículo del cerebelo.Cuatro, preparar larvas infectadas para imágenes confocales.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Fuente: Zhang, X., et al. Un modelo de embrión de pez cebra para la visualización in vivo y el análisis intravital de la infección por Staphylococcus aureus asociada a biomateriales. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra imágenes de fluorescencia de embriones de pez cebra inyectados con Staphylococcus aureus, lo que permite cuantificar la progresión de la infección y la distribución bacteriana para evaluar el impacto de las microesferas de biomateriales en las interacciones huésped-patógeno in...

 Imágenes de fluorescencia de infección bacteriana asociada a biomateriales en embriones de pez cebra

Este video muestra un método para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra. Las esporas de hongos se microinyectan en el ventrículo posterior del cerebro de las larvas y las larvas se incuban para permitir el desarrollo de la infección. Las larvas infectadas se recolectan a intervalos definidos y el progreso de la infección se evalúa mediante la enumeración de las unidades formadoras de colonias.

Una técnica para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra

El video muestra una técnica de dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para observar la infección por patógenos fúngicos marcados con fluorescencia en larvas de pez cebra. La infección inicial atrae a los macrófagos y, a medida que la infección persiste, el reclutamiento de neutrófilos progresa en el lugar de la inyección.

Una técnica zWEDGI para visualizar larvas de pez cebra infectadas con patógenos fúngicos

Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

Aquí, presentamos un protocolo para la generación y obtención de imágenes de una infección bacteriana localizada en la vesícula ótica del pez cebra.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

A continuación, describimos los modelos de pez cebra de xenoinjerto utilizando dos sitios de inyección diferentes, es decir, espacio perivitelino y el conducto de Cuvier, para investigar el comportamiento invasivo y para evaluar el potencial intravasación y la extravasación de células de cáncer de mama humano, respectivamente.

El comportamiento invasivo de las células del cáncer de mama humano en embriones de pez cebra

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.

Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

Este manuscrito describe un método para examinar bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamaño moderado para fenotipos de morfogénesis durante la infección activa en un huésped mamífero utilizando microscopía confocal no invasiva.

Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Aprende a infectar larvas de pez cebra con Candida albicans mediante microinyección en el ventrículo cerebral posterior. Este método permite la imagen no invasiva de interacciones huésped-patógeno en tiempo real.

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

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